Ударно-волновой Применение к клеточных культур
Summary
Ударные волны в настоящее время хорошо известны за их регенеративных эффектов. Поэтому эксперименты в пробирке из растущего интереса. Поэтому мы разработали модель для в пробирке ударных волн исследований (IVSWT), что позволяет нам имитировать в условиях естественных условиях, благодаря чему исключаются отвлекающие физические эффекты.
Abstract
Ударные волны в настоящее время хорошо известны за их регенеративных эффектов. Основные результаты исследований показали, что ударные волны вызывают биологический стимул к клеткам-мишеням или тканей без последующего ущерба. Таким образом, эксперименты в пробирке из растущего интереса. Различные методы нанесения ударные волны на культурах клеток были описаны. В общем, все существующие модели сосредоточиться на том, как лучше применять ударные волны на клетках.
Тем не менее, этот вопрос остается: Что происходит с волнами после прохождения через клеточную культуру? Разность акустического импеданса среды культуры клеток и окружающим воздухом, что высока, что более 99% ударных волн будут отражаться! Поэтому мы разработали модель, которая в основном состоит из оргстекла построен контейнер, который позволяет волны распространяться в воде после прохождения через клеточную культуру. Это позволяет избежать кавитационных эффекты, а также отражение волн, которые могли бы нарушить предстоящих них. Wiй этой модели мы можем имитировать Vivo условия в и таким образом получить больше и больше знаний о том, как физический стимул ударных волн будет преобразован в сигнал биологической клетки ("механотрансдукции").
Introduction
Ударные волны являются звуковые волны давления, возникающие в результате внезапного высвобождения энергии, например. как гром, когда молния. В медицине ударные волны были использованы на протяжении более 30 лет в литотрипсии для распада камней в почках. С побочной нахождения подвздошной кости утолщение в литотрипсии пациентов в начале 1980-х, первые исследования были проведены, чтобы оценить эффект лечения ударно-волновой (SWT) на кости исцеления 1. Впечатляющие результаты улучшения заживления длинных костей несращения можно было наблюдать 2. Впоследствии, показания были расширены на раны мягких тканей 3. Основные результаты исследований показали, что ударные волны вызывают стимул биологической ткани-мишени без последующего повреждения. Выпуск ангиогенных факторов роста (например, VEGF, PLGF, FGF) следует значительной ангиогенеза. Это привело к дальнейшему расширению показаний к ишемических патологий. Наша группа и другие показали положительную эффECT из УВТ по ишемической болезни сердца на животных моделях, а также в клинических испытаниях 4-6.
Тем не менее, точный механизм, как физическое стимулом SWT переводится в биологической сигнала (механотрансдукции) остается неизвестной. Как интереса к SWT от нескольких областях медицины непрерывно увеличивается, стремление к механизму становится все более и более интенсивным. Таким образом, в пробирке ударных волн эксперименты приобретают все большее значение. Кроме сокращения экспериментах на животных и экономической эффективности, самое большое преимущество в пробирке лечения ударной волны (IVSWT) может быть рассмотрена возможность исследования специфическое поведение определенного типа клеток. В ударной волны опосредованного регенерации тканей, скорее всего, все клетки обрабатываемой ткани участвуют, обсуждаются даже системные эффекты. Тем не менее, каждый тип клеток играет особую роль и имеет свою собственную встроенную функцию. IVSWT позволяет обнаружить эту конкретную функцию ай, таким образом, дает нам лучшее понимание сложных основных процессов.
Сегодняшний знания о эффектов ударной волны по клеточных культур включает в себя увеличение пролиферации, изменение рецепторов клеточных мембран, увеличение и ускорение дифференцировки клеток, высвобождение факторов роста и химио-аттрактантов, а также повышенную миграцию клеток 7-9.
Отвлекающие физические эффекты в самых в пробирке моделей различных методов применения ударных волн на клеточных культурах были описаны. Этот факт приводит к проблеме, что это очень трудно сравнивать результаты, как физические условия стимуляции клеток существенно отличаются между этими моделями. В общем, все существующие модели сосредоточиться на том, как лучше применять ударные волны на клетках.
Тем не менее, этот вопрос остается: Что происходит с волнами после прохождения через клеточную культуру? Основная проблема заключается в том, что разница в акустическихимпеданс клеточной культуральной среде и окружающим воздухом, что высока, что более 99% ударных волн будут отражаться Рисунок 1.
Из-за разницы в акустического импеданса двух сред волны не только отражение, но фазового сдвига на 180 ° происходит в результате сильных растягивающих сил на клетки Рисунок 2.
Акустическая сопротивление определяется как произведение плотности материала и его скорость звука Z = ρ х в. Для воды акустический импеданс является ZWater = 1440000 Ns / м 3, для воздуха это только 420 Нс / м 3. Большое различие этих двух величин приводит отражения и сдвига фаз ударных волн. Сдвиг фазы оказывается импульс положительным давлением в растяжение волны.
Даже если это усилие натяжения не является вредным для клеток, он мешает с идеей подражая в естественных условиях ударно-волновых эффектов в пробирке. В естественных условиях этирастягивающие усилия вряд ли произойти из-за больших структур тела.
Кроме того, задняя бегущих волн могут даже мешать входящие. Это может вызвать помехи. Два типа помех известны. Конструктивная интерференция означает, что обе волны добавляются в результате чего в два раза амплитуды рисунке 3. Деструктивная интерференция возникает, если волны встречаются диаметрально противоположны. Это вызывает отмену волн (рис. 3). Поэтому IVSWT нужна модель, которая позволяет ударные волны распространяться после прохождения через клеточную культуру.
Водяная баня IVSWT
Соображения следующие вышеупомянутых проблем приведет нас к разработке ванну воды для избежания описанные проблемы Рисунок 4. В принципе, он состоит из оргстекла построен контейнер с мембраной для подключения каждый вид ударной волны аппликатора. Для связи между этой мембраны и передачи аппликатор ультразвука гел должен быть использован. Водяная баня наполняется дегазированной воды, чтобы избежать кавитации, что произошло бы, если газ растворяется в воде. Нагреватель на дне с помощью датчика температуры, соединенного с блоком управления позволяет регулировать температуру для имитации условий в естественных условиях и, чтобы избежать клеточных культур остыть во время процедуры. Температура может быть привлечен к стабильным на уровне 37 градусов по Цельсию, как это делается в инкубаторе. Держатель для образцов клеток позволяет погружением любой культуральной колбы или трубки. Таким образом, образец сосуд должен быть полностью заполнен культуральной среде, как пузырьки воздуха будет блокировать ударные волны! Клиновидный поглотитель на задней стенке ванны разрушает волны для того, чтобы не отраженного и отбежать, чтобы избежать помех.
Еще одно преимущество для других моделей IVSWT является возможность изменения расстояния между аппликатором и культуральных колбах. Выводы нашей группы и другие лица, использующие эта модель явно ыкак, что каждый тип клеток реагирует очень специально для различных параметров обработки. Кроме того, определение расстояния между источником волн и образцом очень важно, поскольку оно позволяет управлять элементами, чтобы быть в определенном положении по отношению к фокусе ударной волны аппликатора.
Protocol
Representative Results
Discussion
Значимость предложенной модели для экстракорпорального лечения ударной волны является то, что волны могут распространяться после прохождения через клеточную культуру в отличие от существующих моделей. Таким образом, тревожные физические эффекты, такие как растягивающих сил мо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Reiner Schultheiss и Вольфганг Schaden для их вдохновения для этой модели. Мы также благодарим христианскую Dorfmüller за его все время огромные усилия для поддержки нашего исследования.
Большое спасибо Роберт Göschl и Ханс Гогенэггер для тщательного технической реализации наших идей!
Materials
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger – Technical Products | – | |
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipets 25ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | – | |
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| mikrozid disinfectant | Schülke | – | |
| 3,5l degassed water | |||
| paper towels | |||
Referências
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
