Summary
Sjokkbølger i dag er godt kjent for sine regenerative effekter. Derfor in vitro eksperimenter er av økende interesse. Vi har derfor utviklet en modell for in vitro sjokkbølge studier (IVSWT) som gjør oss i stand til å etterligne in vivo forhold og dermed unngå forstyrrende fysiske effekter.
Abstract
Sjokkbølger i dag er godt kjent for sine regenerative effekter. Grunnleggende forskningsresultater viser at sjokkbølger forårsaker en biologisk stimulans til å målrette celler eller vev uten følgeskader. Derfor in vitro eksperimenter er av økende interesse. Forskjellige metoder for påføring av sjokkbølger på cellekulturer er beskrevet. Generelt alle eksisterende modeller fokusere på hvordan du best kan bruke sjokkbølger på celler.
Imidlertid gjenstår spørsmålet: Hva skjer med bølgene etter bestått cellekultur? Forskjellen fra den akustiske impedansen til cellekulturmediet, og den omgivende luft er så høy, at mer enn 99% av sjokkbølger blir reflektert! Vi har derfor utviklet en modell som i hovedsak består av en pleksiglass bygget beholder som gjør det mulig for bølgene å forplante seg i vann etter å ha passert cellekultur. Dette unngår kavitasjon effekter samt refleksjon av bølger som ellers ville forstyrre kommende dem. With denne modellen er vi i stand til å etterligne in vivo-forhold og dermed få mer og mer kunnskap om hvordan den fysiske stimulans av sjokkbølger blir oversatt til en biologisk celle signal ("mechanotransduction").
Introduction
Sjokkbølger er lydtrykkbølger som følge av en plutselig frigjøring av energi, f.eks. som torden når lyn. I medisin sjokkbølger har blitt brukt i over 30 år i Litotripsi for oppløsningen av nyrestein. Siden tilfeldig funn av iliac bein fortykkelse i Litotripsi pasienter i 1980, ble det første studier utført for å evaluere effekten av sjokkbølgebehandling (SWT) på bein healing en. Imponerende resultater av forbedret healing av lange ben nonunions kunne observeres to. Deretter indikasjoner ble utvidet til bløtvev sår tre. Grunnleggende forskningsresultater viser at sjokkbølger forårsaker en biologisk stimulans til målet vev uten følgeskader. Frigjøring av angiogene vekstfaktorer (for eksempel VEGF, PlGF, FGF) etterfølges av betydelig angiogenese. Dette førte til en ytterligere utvidelse av indikasjoner mot iskemiske patologi. Vår gruppe og andre viste den positive effekten av SWT på ischemisk hjertesykdom i dyremodeller og i kliniske forsøk 4-6.
Men den eksakte mekanismen for hvordan fysisk stimulans av SWT er oversatt til et biologisk signal (mechanotransduction) er fortsatt i stor grad ukjent. Ettersom interessen for SWT fra flere felt av medisin øker kontinuerlig, er søken etter den mekanismen blir mer og mer intens. Derfor er in vitro bølge eksperimenter sjokk stadig viktigere. Foruten reduksjon av dyreforsøk og kostnadseffektivitet, kan den største fordelen av in vitro sjokkbølgebehandling (IVSWT) være mulighet for å studere den spesifikke atferden til en bestemt celletype. I sjokkbølge mediert vevsregenerering sannsynligvis alle celler i det behandlede vev er involvert, er enda systemiske effekter diskutert. Likevel spiller hver celletype en bestemt rolle og har sin egen iboende funksjon. IVSWT gjør oss i stand til å oppdage denne bestemte funksjonen ennd dermed gir oss bedre forståelse av de komplekse underliggende prosesser.
Dagens kunnskap om støtbølge virkninger på cellekulturer omfatter økning av proliferasjon, endring av celle-membranreseptorer, øke og akselerering av celledifferensiering, frigjøring av vekstfaktorer og kjemo-tiltrekningsmidler, så vel som økt cellemigrasjon 7-9.
Forstyrrende fysiske effekter i de fleste in vitro-modeller ulike metoder for å bruke sjokkbølger på cellekulturer har blitt beskrevet. Dette faktum fører til det problem at det er meget vanskelig å sammenligne resultatene, som fysiske betingelser for cellestimulering er ganske forskjellig mellom disse modellene. Generelt alle eksisterende modeller fokusere på hvordan du best kan bruke sjokkbølger på celler.
Imidlertid gjenstår spørsmålet: Hva skjer med bølgene etter bestått cellekultur? Hovedproblemet er at forskjellen på det akustiskeimpedansen av cellekulturmediet, og den omgivende luft er så høy, at mer enn 99% av sjokkbølger blir reflektert figur 1.
På grunn av forskjellen i akustisk impedans mellom de to medier bølger blir ikke bare reflekteres, men en fase-forskyvning på 180 ° forekommer noe som resulterer i sterke strekkrefter til cellene Figur 2..
Akustisk impedans er definert som produktet av tettheten av et materiale og dets lydhastighet Z = ρ x c. For vann den akustiske impedansen er ZWater = 1440000 Ns / m 3, for luft det er bare 420 Ns / m 3. Den store forskjell mellom disse to verdier gir refleksjon og faseforskyvning av sjokkbølger. Den faseforskyvning slår en positiv trykkpuls inn i en strekkbølge.
Selv om denne strekkraft ikke er skadelige for cellene, griper det med tanken på å etterligne in vivo sjokkbølgevirkninger in vitro. In vivo dissestrekkrefter neppe oppstå på grunn av store kroppsstruktur.
Videre kan baksiden løpende bølger selv forstyrrer de innkommende seg. Dette kan føre til forstyrrelser. To typer forstyrrelser er kjent. Konstruktiv interferens betyr at begge bølger legges dermed resultere i doblet amplitude Figur 3. Destruktiv interferens oppstår hvis bølger møtes diametralt motsatt. Det fører til nedlegging av bølger (figur 3). Derfor trenger IVSWT en modell som gjør det mulig for trykkbølger til å forplante seg etter passering av cellekultur.
IVSWT vannbad
Hensyn Etter ovennevnte bekymringer føre oss til å designe et vannbad for å unngå de beskrevne problemene Figur 4. Utgangspunktet består det av et pleksiglass bygget beholder med en membran for å koble alle slags sjokkbølge applikator. For kopling mellom dette membran og applikatoren ultralydoverførings gel har til å bli brukt. I vannbadet er fylt med avgasset vann for å unngå kavitasjon som ville oppstå hvis gassen ble soluted i vannet. Et varmeelement i bunnen med en temperaturføler som er koblet til en styreenhet gjør det mulig å regulere temperaturen for etterligning av in vivo-betingelser, og for å unngå cellekulturer avkjøles under prosedyren. Temperaturen kan holdes stabilt på 37 grader celsius som det er gjort i en inkubator. En holder for celleprøver gjør det mulig å dyppe en hvilken som helst form for kulturen kolbe eller rør. Derved må prøven fartøyet for å bli fullstendig fylt med dyrkningsmedium, ettersom luftbobler vil blokkere sjokkbølger! En kileformet absorber på bakveggen av badekaret destructs bølger for ikke å bli reflektert og kjøres tilbake for å unngå interferens.
En ytterligere fordel med andre IVSWT modeller er muligheten for å variere avstanden mellom påføringsinnretningen og kulturflasker. Funn av vår gruppe og andre som bruker denne modellen klart erhvordan at hver celletype reagerer svært spesifikt til ulike behandlingsparametere. Videre bestemmer avstanden mellom kilden av bølgene, og prøven er viktig da det gjør det mulig å kontrollere cellene til å være på en bestemt posisjon i forhold til vekt av sjokkbølgen applikator.
Protocol
Representative Results
Discussion
Betydningen av den foreslåtte modell for in vitro-sjokkbølgebehandling er det faktum at bølger kan forplante seg etter passering av cellekultur i motsetning til eksisterende modeller. Derved kan forstyrrende fysikalske effekter som for eksempel strekk-krefter unngås. Modellen mer ligner in vivo forhold enn at ved andre søker bølger til sine cellekulturflasker direkte.
En ytterligere fordel er muligheten for å variere avstanden mellom sjokkbølgen kilde og celler. Det…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Reiner Schultheiss og Wolfgang Schaden for deres inspirasjon for denne modellen. Vi vil også takke Christian Dorfmüller for hans all time enorm innsats for å støtte vår forskning.
Mange takk til Robert Göschl og Hans Hohenegger for forsiktig teknisk realisering av våre ideer!
Materials
| Orthogold shock wave device | Tissue Regeneration Technologies, Woodstock, GA – manufactured by MTS-Europe GmbH, Konstanz, Germany | ||
| IVSWT Water Bath V2.0 | Johann Hohenegger – Technical Products | – | |
| EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl.&Growth Factors | Lonza | CC-3156 & CC-4176 | This medium was used for the shown experiments with HUVECs to fill the cell culture flask. For other cell types, use the recommended medium. |
| Pechiney Parafilm M PM996 | Pechiney Plastic Packaging | PH-LF-PM996-EA at labplanet.com | for sealing flasks |
| Falcon Serological pipets 25ml | Becton Dickinson Labware | 357525 | |
| CellMate II Serological Pipette | Matrix Technologies | – | |
| Skintact Ultrasonic Gel | Skintact | UL-01 250 ml | |
| T25 cell culture flasks | COSTAR | 3056 | |
| mikrozid disinfectant | Schülke | – | |
| 3,5l degassed water | |||
| paper towels | |||
Referências
- Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. Influence of shock waves on fracture healing. Urology. 39, 529-532 (1992).
- Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union. Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).
- Schaden, W., et al. Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study. J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).
- Tepeköylü, C., et al. Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).
- Nishida, T., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo. Circulation. 110, 3055-3061 (2004).
- Fukumoto, Y., et al. Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease. Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).
- Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment. FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).
- Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).
- Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis. Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).
