कैंसर स्टेम सेल फेनोटाइप के साथ कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए सीरम मुक्त न्यूरोस्फीयर माध्यम में वियोजन उच्च ग्रेड ग्लियोमा सर्जिकल नमूनों के प्रचार के लिए प्रोटोकॉल। उन नमूनों के लिए जो न्यूरोस्फीयर के रूप में विकसित होने में विफल रहते हैं, एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल का सुझाव दिया जाता है। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के लिए 3डी न्यूरोस्फीयर आर्किटेक्चर को बनाए रखने के लिए पैराफिन एम्बेडिंग तकनीक का वर्णन किया गया है।
ग्लियोब्लास्टोमा, एस्ट्रोसाइटोमा का सबसे आम और आक्रामक रूप, चिकित्सा के लिए रिफ्रैक्टरी हैं, और आणविक रूप से विषम हैं। कोशिका संस्कृतियों कि माता पिता के ट्यूमर के जीनोमिक प्रोफ़ाइल की रक्षा करने की क्षमता, रोगी विशिष्ट इन विट्रो में उपयोग के लिए और वीवो मॉडल में, प्रत्येक ट्यूमर की आणविक विशेषताओं के अनुरूप ग्लियोब्लास्टोमा के लिए नए उपचार के पूर्व नैदानिक विकास में क्रांतिकारी बदलाव करने की क्षमता है ।
ताजा उच्च ग्रेड एस्ट्रोसाइटोमा ट्यूमर एकल कोशिकाओं में अलग के साथ शुरू, हम तंत्रिका स्टेम सेल फेनोटाइप पेश कोशिकाओं के लिए एक संवर्धन विधि के रूप में न्यूरोस्फीयर परख का उपयोग करते हैं, जिसमें तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति, विट्रो मेंदीर्घकालिक आत्म-नवीकरण और ऑर्थोटोपिक ज़ेनोग्रैफ्ट ट्यूमर बनाने की क्षमता शामिल है। इस विधि को पहले प्रस्तावित किया गया है, और अब कई जांचकर्ताओं द्वारा उपयोग में है। 125 ग्लियोब्लास्टोमा नमूनों को अलग करने और बनाने के हमारे अनुभव के आधार पर, हम यहां मौजूद विस्तृत प्रोटोकॉल पर पहुंचे, जो उच्च ग्रेड एस्ट्रोसाइटोमा के नियमित न्यूरोस्फीयर संस्कृति और प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए ट्यूमरजेनिक कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर विस्तार के लिए उपयुक्त है। हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके सफल दीर्घकालिक संस्कृतियों की दक्षता पर रिपोर्ट करते हैं और अलग-अलग ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को बनाने के लिए किफायती विकल्प सुझाते हैं जो न्यूरोस्फीयर के रूप में विकसित होने में विफल रहते हैं। हम इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए न्यूरोस्फीयर 3 डी आर्किटेक्चर के संरक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं। सीएससी में समृद्ध सेल संस्कृतियां, जो आणविक हस्ताक्षर और जीबीएमएस की विषमता को संरक्षित करने वाले ऑर्थोटोपिक ज़ेनोबेड़ा मॉडल पैदा करने में सक्षम हैं, जीबीएमएस के जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए और संभावित उपचारों के पूर्व नैदानिक परीक्षण के बेहतर डिजाइन के लिए तेजी से लोकप्रिय हो रही हैं।
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), एक डब्ल्यूएचओ ग्रेड चतुर्थ एस्ट्रोसाइटोमा, सबसे प्रचलित और आक्रामक प्राथमिक ब्रेन ट्यूमर है । विविध विकासात्मक फेनोटाइप जीबीएम ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा अपनाए जाते हैं, जिनमें “कैंसर स्टेम सेल” (सीएससी) विशेषताओं का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाएं शामिल हैं, जैसे तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) मार्कर की अभिव्यक्ति, दीर्घकालिक आत्म-नवीकरण, और अधिक विभेदित कोशिकाओं को एस्ट्रोसाइटिक मार्कर व्यक्त करने और ट्यूमर1-3के थोक बनाने की क्षमता। हालांकि सीएससी आणविक पहचान और नैदानिक प्रभावों के बारे में स्पष्टीकरण अभी भी आवश्यक है, वर्तमान कार्य का ध्यान सीएससी की परिचालन परिभाषा पर है: दीर्घकालिक स्व-नवीकरण इन विट्रो और इम्यूनोकोम वादा किए गए कृंतक में ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण पर मूल ट्यूमर को अलग और पुन: पेश करने की क्षमता।
ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को पारंपरिक माध्यम में दशकों से सुसंस्कृत किया गया है जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और कई उच्च मार्ग वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध सीरम सुसंस्कृत जीबीएम सेल लाइनें इम्यूनोकॉम् वादा किए गए कृंतक में ट्यूमरजेनिक हैं, लेकिन मूल ट्यूमर4से काफी जीनोमिक और आणविक विचलन है, जो उनके उपयोग को चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मॉडल के रूप में सीमित करता है। हाल ही में, जीईएफ और बीएमजीएफ के प्रति उत्तरदायी स्टेम/प्रोजेनिटर फेनोटाइप वाली कोशिकाओं की पहचान जीबीएमएस2में की गई थी । इसके बाद, एक सीरम-मुक्त माध्यम3में अलग-अलग जीबीएम ट्यूमर के नमूनों को सुसंस्कृत किया गया था, जो मूल रूप से वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क5से तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के चयन और विस्तार के लिए तैयार किया गया था। ये संस्कृति की स्थिति अधिकांश गैर-नीरस और अधिक विभेदित ट्यूमर सेल आबादी के विकास में बाधा डालती है, जबकि फ्लोटिंग मल्टीसेलुलर स्फेरॉइड, या न्यूरोस्फेर3के रूप में स्टेम और प्रोजेनिटर कोशिकाओं के विकास के पक्ष में, वयस्क स्तनधारी तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के व्यवहार की नकल करतेहुए 5। प्राथमिक जीबीएम कोशिकाओं की तुलना में व्यापक साथ-साथ विकास कारकों (एनएमजीएफ) के साथ पूरक या 10% एफबीएस के साथ पूरक पारंपरिक विकास माध्यम में, पता चला कि जीबीएम न्यूरोस्फेर्स ट्यूमरजेनिक थे, मल्टीलाइनेज भेदभाव क्षमता प्रस्तुत करते थे, और मूल ट्यूमर के जीनोटाइप को संरक्षित करते थे, 10% एफबीएस संस्कृतियों के विपरीत जो कम मार्ग पर ट्यूमरजेनिक नहीं थे और देर से मार्ग4पर मूल ट्यूमर से काफी हट गए थे।
ख्यात सीएससी मार्कर सीडी 133 की अभिव्यक्ति के आधार पर सेल छंटाई द्वारा अलग GBM ट्यूमर से सीएससी के अलगाव भी6,7प्रस्तावित किया गया है, लेकिन आगे काम संकेत दिया है कि सीएससी फेनोटाइप निश्चित रूप से इस तरह के मार्कर8-10की अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा हुआ नहीं है, इस रणनीति के लिए प्रारंभिक उत्साह कम है, जबकि नए मार्कर अभी भी10परीक्षण किया जा रहा है । सीएससी को परिभाषित करने वाले मार्कर के एक मान्य सेट की तारीख तक अनुपलब्धता, पूर्व नैदानिक अध्ययनों के लिए इन कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर प्रवर्धन के लक्ष्य के साथ, नियमित सीएससी-समृद्ध संस्कृतियों के लिए अव्यावहारिक कोशिका छंटाई का उपयोग प्रदान करता है। एनएमजीएफ में न्यूरोस्फीयर के रूप में विकसित होने की क्षमता द्वारा चयनित जीबीएम कोशिकाएं निरपवाद रूप से तंत्रिका स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करती हैं। हमने देखा है कि Sox2 और nestin सर्वव्यापी रूप से न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों में व्यक्त किए जाते हैं, जबकि CD133 प्रोटीन जीबीएम न्यूरोस्फीयर (अप्रकाशित डेटा और संदर्भ11)के सबसेट में मौजूद है।
कई प्रयोगशालाएं 3,4,11-14के विकास कारकों के साथ पूरक सीरम-मुक्त माध्यम में एंजाइमेटिक वियोजन और संस्कृति के समान सामान्य दृष्टिकोण का उपयोग करके ग्लियोब्लास्टोमा ट्यूमर से न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों का पीछा कर रही हैं, जबकि अन्य सहयोगियों ने सफलता के बिना जीबीएमनमूनोंसे दीर्घकालिक न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को विकसित करने के प्रयासों की सूचना दी है। यहां प्रस्तुत उच्च ग्रेड ग्लियोमास की एंजाइमेटिक वियोजन और न्यूरोस्फीयर संस्कृति के लिए सामान्य विधि उपरोक्त प्रकाशनों में उल्लिखित की गई है। हमने 100 जीबीएम नमूनों पर अलग और खेती के हमारे अनुभव के आधार पर प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल लागू करने वाले ताजा जीबीएम नमूनों से दीर्घकालिक न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों को प्राप्त करने की दक्षता 40% से अधिक है, जो दक्षता डेटा3,15दिखाने वाली कुछ रिपोर्टों के समान है, जिससे वैकल्पिक प्रोटोकॉल जैसे सीईएफ और बीएफजीएफ की उपस्थिति में सीरम-मुक्त माध्यम में लगातार या आंतरायिक रूप से ईसीएम प्रोटीन16 17के साथ लेपित सतहों पर मोनोलेयर जैसे वैकल्पिक प्रोटोकॉल की खोज की जा रही है। न्यूरोस्फीयर संस्कृतियां अभी भी जीबीएम ट्यूमर आणविक विशेषताओं और ट्यूमरजनित क्षमता3, 4, 11-14को संरक्षित करने के लिए सबसे मान्य और तेजी से लोकप्रिय दृष्टिकोण हैं, इस प्रकार हमारा दृष्टिकोण पहले न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों का प्रयास करना है, जीबीएम कोशिकाओं को बनाने के लिए वैकल्पिक तरीकों का समान रूप से परीक्षण करते हुए जो दीर्घकालिक स्व-नवीनीकरण न्यूरोस्फीयर(चित्रा 1)बनाने में विफल रहते हैं, ताकि पशु मॉडलों में उपयोग किए जा सकते हैं। यहां हम जीबीएम से न्यूरोस्फीयर को बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। उन कोशिकाओं के लिए जो न्यूरोस्फीयर बनाने में विफल रहते हैं, हम विकास माध्यम में एक सरल संशोधन दिखाते हैं, क्योंकि गैर-न्यूरोस्फीष से ट्यूमरजन्य कोशिकाओं को जीबीएमएस बनाने का पहला प्रयास है, जिसमें आशाजनक परिणाम हैं और अभी भी व्यापक सत्यापन के दौर से गुजर रहे हैं।
उचित एंजाइमेटिक ट्यूमर सेल वियोजन इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। ऊतक को रोटेशन के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल वियोजन समाधान में इनक्यूबेशन से पहले अच्छी तरह से कीमा बनाया जाना चाहिए, न्यूनतम 30 मिनट के लिए, जब ऊतक को यांत्रिक रूप से त्रिसंतुरित किया जाना चाहिए और वियोजन का विस्तार सत्यापित किया जाना चाहिए। ऊतक सामंजस्य की डिग्री के आधार पर, इनक्यूबेशन अतिरिक्त 15-30 मिनट के लिए बढ़ाया जा सकता है, के रूप में एकल कोशिकाओं में वियोजन को पूरा करने की जरूरत है । 1 घंटे से अधिक समय तक वियोजन समाधान में इनक्यूबेशन की सिफारिश कोशिका व्यवहार्यता में कमी के कारण नहीं की जाती है। हालांकि शुरू ऊतक की इष्टतम राशि 200-500 मिलीग्राम है, इस प्रोटोकॉल के रूप में ट्यूमर ऊतक के रूप में छोटे रूप में ५० मिलीग्राम से सफल न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों के लिए नेतृत्व किया गया है ।
सीरम-मुक्त एनएमजीएफ एक चयनात्मक माध्यम है, और ट्यूमर के थोक, साथ ही मेजबान कोशिकाओं को शामिल करने वाली नियोप्लास्टिक कोशिकाओं का प्रतिशत जीवित नहीं रहेगा, जबकि अन्य चढ़ाना के बाद ऊतक संस्कृति का इलाज फ्लास्क से जोड़ते हैं। यह महत्वपूर्ण है कि न्यूरोस्फीयर जो 1-3 सप्ताह(आंकड़े 1B-ई)से अधिक होगा, को विभेदित ट्यूमर कोशिकाओं और मलबे से अलग करने के लिए ताजा फ्लास्क में स्थानांतरित कर दिया जाता है।
जीबीएम कोशिकाओं को एंजाइमेटिक रूप से अलग किया गया है और कभी सुसंस्कृत (चरण 1.10) को वैकल्पिक मीडिया में संस्कृति के लिए कोशिकाओं के बैकअप स्रोत के रूप में क्रायोप्रेयरक किया जा सकता है, यदि न्यूरोस्फेयर संस्कृति विफल हो जाती है। हम सफलतापूर्वक इस तरह के जमे हुए शेयरों से न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों प्राप्त की है, साथ ही मोनोलेयर कोशिकाओं 2% FBS/NMGF में बढ़ रही है ।
संकल्पनात्मक रूप से, “कैंसर स्टेम सेल” प्रगति में एक काम है और इस उभरते क्षेत्र को अतिरिक्त स्पष्टीकरण से लाभ होगा, क्योंकि नैदानिक निहितार्थ काफी हैं, विशेष रूप से ट्यूमर विषमता, प्लास्टिसिटी की पीढ़ी में, और चिकित्सा के प्रतिरोध19,20। रोगी-विशिष्ट जीबीएम पशु मॉडल पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण होने के अलावा, न्यूरोस्फीयर संस्कृतियां इन विट्रो अध्ययनों के लिए भी मूल्यवान हैं जैसे कि विकास कारकों, हाइपोक्सिया और औषधीय एजेंटों के जवाब में सेल सिग्नलिंग और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन11,21। हमने पूरे क्षेत्र को लेबलिंग और इमेजिंग की अधिक सामान्य विधि के संबंध में बेहतर उपकोशिकीय स्थानीयकरण के कारण, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री11द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का अध्ययन करने के लिए, 3 डी आर्किटेक्चर को संरक्षित करते हुए, फॉर्मेलिन फिक्स्ड और पैराफिन एम्बेडेड न्यूरोस्फीयर के क्रॉस-सेक्शन का उपयोग करने का विकल्प चुना है।
यह दर्शाया गया है कि वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क से प्राप्त न्यूरोस्फेयर के भीतर सभी कोशिकाएं स्टेम सेलनहींहैं . इसी तरह, जीबीएम ट्यूमर से सुसंस्कृत न्यूरोस्फीयर अधिक विभेदित कैंसर जनक कोशिकाओं और आत्म-एकत्रीकरण की उपस्थिति के कारण क्लोनल नहीं होते हैं, जो उच्च कोशिका घनत्व23पर होने के लिए जाना जाता है, जिसे कुछ द्वारा इस विधि की सीमा माना जाता है। दीर्घकालिक आत्म-नवीनीकरण स्टेम कोशिकाओं के लिए संवर्धन का पक्ष लेने के लिए, जैसा कि सिर्फ जनकों के विपरीत है जो क्षणिक रूप से न्यूरोस्फीयर22के रूप में विकसित हो सकते हैं, प्राथमिक न्यूरोस्फीयर माध्यमिक न्यूरोस्फीयर गठन के लिए अलग हो जाते हैं, और आगे न्यूनतम 10 मार्ग के लिए मार्ग, लगभग 2 महीने के बराबर लगातार संस्कृति में, जो स्टेम सेल में समृद्ध आबादी का संकेत है22। हमारे अनुभव में, जीबीएम न्यूरोस्फीयर संस्कृतियों है कि उस निशान को प्राप्त करने के लिए अनिश्चित काल के रूप में न्यूरोस्फीयर के रूप में विस्तार किया जा सकता है । ट्यूमर ग्रेड मायने रखती है, क्योंकि हमने क्रमशः जीबीएमएस और एनाप्लास्टिक एस्ट्रोसाइटोमा, डब्ल्यूएचओ ग्रेड चतुर्थ और III से सफल संस्कृतियों को प्राप्त किया है, लेकिन निचले ग्रेड ग्लियोमा से नहीं।
10% एफबीएस के साथ पूरक पारंपरिक विकास माध्यम में ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं को बनाने की सबसे प्रचलित विधि, मूल ट्यूमर 4 से काफी जीनोमिक और फेनोटाइपिक विचलन की ओर जाताहै। दूसरी ओर, न्यूरोस्फीयर संस्कृतियां कैंसर स्टेम सेल फेनोटाइप 4 पेश करने वाली कोशिकाओं का एक स्थिर औरदीर्घकालिकस्रोत हैं। न्यूरोस्फीयर विधि सभी उच्च ग्रेड एस्ट्रोसाइटोमा नमूनों के लिए सफल नहीं होने के बावजूद ऑर्थोटोपिक माउस ज़ेनोबेड़ा मॉडल के लिए दीर्घकालिक संस्कृतियों में सीएससी के संवर्धन के लिए तेजी से लोकप्रिय हो गई है, जो इस विधि की मुख्य कमजोरी का प्रतिनिधित्व करती है। यह समझने के लिए अध्ययन चल रहे हैं कि माता-पिता के ट्यूमर की आणविक विशेषताएं न्यूरोस्फीयर गठन को कैसे प्रभावित कर सकती हैं। उच्च ग्रेड ग्लियोमा संस्कृति के लिए व्यावहारिक वैकल्पिक तरीकों की खोज, व्यापक सत्यापन के बाद, रोगी विशिष्ट GBM मॉडल होने के महत्वपूर्ण लाभों को देखते हुए, के रूप में हम व्यक्तिगत चिकित्सा के एक युग में अग्रिम, “omics” जानकारी की पहुंच और संभावित लक्षित चिकित्सा की संख्या में वृद्धि से प्रेरित ।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को हर्मेलिन ब्रेन ट्यूमर सेंटर, हेनरी फोर्ड हॉस्पिटल द्वारा वित्त पोषित किया गया है ।
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
Trypsin – EDTA 0.05% | Life Technologies | 25300-054 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, calcium- and magnesium-free | Life Technologies | 14170-120 | |
Hank’s Balanced Salt Solution, with calcium and magnesium | Life Technologies | 24020-117 | |
Collagenase Type 4 | Worthington | 5004188 | |
Trypsin Inhibitor | Sigma | T7659 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
N2 Supplement (100x) | Life Technologies | 17502-048 | |
Albumin from Bovine Serum, cell culture grade | Sigma | A4919 | |
Gentamicin Reagent Solution | Life Technologies | 15710-064 | |
Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Lympholyte-Mouse | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL5031 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Life Technologies | 12648-010 | |
Sterile Cell Strainer, 40 μm | Fisher | 22363547 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS), no calcium and no magnesium | Life Technologies | 14190-144 | |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
Trypan Blue Stain, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Neutral Buffered Formalin | Protocol | 245-684 | |
Histoplex Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 22-146-426 | |
Rotator | Miltenyi BioTec | 130-090-753 | |
GlutaMAX Supplement | Life Technologies | 35050-061 | |
KnockOut D-MEM/F12 | Life Technologies | 12660-012 | |
Stem Pro Neural Supplement | Life Technologies | A1058-01 |