Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados en<sup> 15</sup> N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas
Summary
El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.
Abstract
El protocolo introducido proporciona una herramienta para el análisis de complejos multiproteicos en la membrana tilacoide, mediante la revelación de conocimientos sobre composición compleja en diferentes condiciones. En este protocolo el enfoque se demuestra mediante la comparación de la composición de la proteína complejo responsable de flujo cíclico de electrones (CEF) en Chlamydomonas reinhardtii, aislado a partir de diferentes cepas genéticamente. El procedimiento comprende el aislamiento de membranas tilacoides, seguido por su separación en complejos multiproteicos por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, SDS-PAGE, y la inmunodetección, espectrometría de masas cuantitativa comparativa (MS) basados en el marcaje metabólico diferencial (14 N / 15 N) de la cepas analizadas. Membranas tilacoides solubilizados detergentes se cargan en gradientes de densidad de sacarosa en una concentración igual clorofila. Después de ultracentrifugación, los gradientes se separan en fracciones, que se analizan en masa-spectrometry basado en el mismo volumen. Este enfoque permite la investigación de la composición dentro de las fracciones de gradiente y, además, para analizar el comportamiento de la migración de diferentes proteínas, centrándose especialmente en ANR1, CAS, y PGRL1. Además, este método se demuestra mediante la confirmación de los resultados con inmunotransferencia y además, mediante el apoyo a los hallazgos de los estudios anteriores (la identificación y la migración PSI-dependiente de las proteínas que se describieron anteriormente para ser parte de la CEF-Supercomplejo tales como PGRL1, FNR, y cyt f). Cabe destacar que este enfoque es aplicable a abordar una amplia gama de preguntas para las que este protocolo se puede adoptar y, por ejemplo utilizado para los análisis comparativos de composición compleja multiproteico aislado de las condiciones ambientales distintas.
Introduction
Procesos fotosintéticos en las membranas tilacoides de plantas y algas pueden funcionar en un modo lineal y cíclica. Durante el flujo lineal de electrones (LEF) fotosistema I (PSI), fotosistema II (PSII) y citocromo b 6 / f en última instancia, la transferencia de electrones del agua al NADP + 1, que conduce a la generación de NADPH y ATP 2. En contraste, el flujo cíclico de electrones (CEF), que es conocido por ser inducida bajo diversas condiciones ambientales como el estado 2 3 y 4, las condiciones anaeróbicas en los resultados de la re-reducción de la ISP oxidado mediante la inyección de electrones de nuevo en la cadena de transporte de electrones. Este proceso puede llevarse a cabo en el lado del estroma del citocromo b 6 / f complejo 1 o en la piscina plastoquinona 5 y genera ATP, pero no NADPH 2.
El objetivo del protocolo presentado es demostrar una espectrometría de masas (MS) m basadaétodo para el análisis comparativo, cuantitativo de los complejos multiproteicos en las membranas tilacoides de Chlamydomonas reinhardtii que permite conocer mejor la composición de estos complejos en diferentes condiciones (ejemplificados mediante la comparación de cepas genéticamente diferentes). Este enfoque fue aplicado en una publicación de Terashima et al. En 2012 que muestra una Ca 2 +-dependiente de la regulación de la CEF en C. reinhardtii mediada por un complejo multiproteicos incluyendo las proteínas de CAS, ANR1 y PGRL1 6. El procedimiento se explica por comparativamente el análisis de la composición de la CEF-Supercomplejo en dos cepas genéticamente diferentes, aprovechando de este modo el etiquetado una de las dos cepas con nitrógeno pesado (15 N). Brevemente, el protocolo incluye la preparación de membranas tilacoides, seguido de la solubilización de detergente y fraccionamiento de complejos fotosintéticos en un gradiente de densidad de sacarosa. Después del fraccionamiento de la pendiente, seleccionado fracnes de dos cepas se mezclaron basan en un volumen igual, separadas por SDS-PAGE seguido de la digestión en gel y análisis por MS cuantitativa posterior.
Como se mencionó anteriormente, CEF es inducida bajo diferentes condiciones ambientales y una publicación a partir de 2010 demuestra el aislamiento de un CEF-Supercomplejo funcional de estado 2 celdas bloqueadas de C. reinhardtii 7, que se lleva a cabo mediante la separación de las membranas tilacoides solubilizadas en un gradiente de densidad de sacarosa durante la ultracentrifugación. A diferencia de Iwai et al. 7, el protocolo presentado describe el aislamiento de la CEF-Supercomplejo de anaeróbico crecido C. culturas reinhardtii siguiendo un procedimiento alternativo. Este comprende cambios en el protocolo de aislamiento de tilacoide así como las diferencias relativas a la etapa de solubilización y la separación de complejos de proteínas por ultracentrifugación. En el presente protocolo, las membranas tilacoidesestán aislados mediante la aplicación del procedimiento publicado por Chua y Bennoun 8, mientras que los tampones usados para la preparación tilacoide por Iwai et al. contenida Mes 25 mM, 0,33 M de sacarosa, 5 mM de MgCl 2, 1,5 mM de NaCl (pH 6,5) como se describe 9. La solubilización se realizó con 0,7-0,8% de detergente (n-tridecilo-β-D-maltósido) durante 30 min en hielo en el caso de Iwai y compañeros de trabajo, mientras que el método de solubilización descrito aquí se basa en el uso de 0,9% de detergente (N -dodecil-β-D-maltósido (β-DM)) y se lleva a cabo por sólo 20 min en hielo. Ambos grupos utilizaron 0,8 mg de clorofila por ml para la solubilización con la respectiva detergente. Para la separación de los complejos fotosintéticos de las membranas tilacoides solubilizadas Iwai et al. Aplicado concentraciones de sacarosa entre 0,1-1,3 M, mientras que los autores de este protocolo utilizado concentraciones que van desde 0,4 hasta 1,3 M. La última diferencia es la velocidad de centrifugación, que es más baja en comparación A la cupublicación rlier.
La solubilización de las membranas tilacoides con detergentes no iónicos, seguido de fraccionamiento de gradiente de densidad de sacarosa ya se ha aplicado en numerosos estudios que van desde la década de 1980 hasta hoy 7, 9-14 y también la aplicación de marcaje metabólico de las proteínas es un método muy extendido en el campo de la proteómica. El enfoque descrito se aplica el etiquetado 15 N metabólica para una de las dos cepas en comparación mediante el cultivo en presencia de nitrógeno pesado como única fuente de nitrógeno en forma de 15 N NH4Cl, que se incorpora en todos los aminoácidos que conducen a una masa cambiar dependiendo de la secuencia de aminoácidos del péptido. Cuando el análisis de una mezcla de 14 N y 15 N dentro de una MS ejecuta, este cambio de masa se puede utilizar para determinar el origen de la muestra para cada péptido y péptido relativa abundancia se puede calcular que representa la abundancia relativa para la correspondening proteína de 15.
Numerosos estudios de proteómica cuantitativa sobre C. reinhardtii están disponibles, que compara una cantidad definida de proteínas para analizar los cambios en el proteoma entre las condiciones experimentales (por ejemplo, cambios en el proteoma de nutrientes debido a la 16-19 o la luz de estrés 20,21). En comparación con los estudios, en el enfoque que actualmente se presenta se combinaron y analizaron volúmenes iguales de muestras. Esta configuración permite estudiar el comportamiento de la migración de las proteínas dentro del gradiente y, además, para analizar la composición de diferentes complejos con respecto a las cepas investigadas.
Este método se explicará mediante la concentración principalmente en tres proteínas: El primer candidato es la proteína sensor de calcio CAS-cloroplasto localizada, que ha demostrado estar implicado en la foto-aclimatación en C. reinhardtii 22. El calcio se considera que es una señal importanteción de iones de las vías que se activan debido a diferentes estreses bióticos y abióticos, finalmente, conduce a cambios en la expresión genética y la fisiología celular 23 y se propuso que los cloroplastos podrían contribuir a celular Ca 2 + señalización a través de la proteína CAS 22,24,25. La segunda proteína es ANR1 (respuesta anaeróbica 1 6), una proteína que ha demostrado ser inducida en condiciones de crecimiento anóxicas en C. reinhardtii 26. En particular, CAS, así como ANR1 se identificaron como subunidades de la CEF-Supercomplejo y por otra parte, mediante el uso de enfoques de genética inversa, se demostró que ambas proteínas contribuyen funcionalmente a CEF in vivo 6, apoyando su papel como subunidades funcionales de este complejo de proteínas. La tercera proteína es la proteína tilacoide PGR5-igual que 1 (PGRL1), que ha demostrado estar involucrados en CEF en Chlamydomonas 4,27, así como en Arabidopsis 5,28 y era también identified en la obra de Iwai et al. 7
Este enfoque será presentado por muestra los resultados de dos experimentos diferentes: de tipo salvaje (WT) versus (vs) una cepa ΔPSI 29, que presenta una deleción del gen PSAB, que codifica para un fotosistema esencial que la subunidad, que es también parte de la CEF-Supercomplejo y WT vs un pgrl1 ronda cepa 4. Para cada uno de esos experimentos la composición cuantitativa de la CEF-Supercomplejo entre un N-y una cepa 14 N-etiquetados se ha comparado 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diferentes estudios proteómicos cuantitativos utilizando el etiquetado de isótopos estables se han publicado en los últimos años. En estos experimentos se comparan generalmente de dos muestras diferentes, de las cuales una muestra se marca con un isótopo estable. A partir de entonces las proteínas o péptidos de las dos muestras se combinan en una proporción igual y procesados adicionalmente juntos 48. Estos estudios a menudo tienen la intención de comparar los compartimentos definidos aislados …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MH reconoce el apoyo de la "Deutsche Forschungsgemeinschaft" (DFG). Autor contribuciones: MH diseñado investigación; KT, JS y MT realiza investigación y analizó los datos; KT y MH escribió el documento.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0662 | |
| Acetone | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2300 | |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
9340 | harmful, work with gloves see protocol text for further precautions |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
39466-62-1 | |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0988 | |
| Ammonium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3583 | |
| Ammonium sulfate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3598 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
10041653 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0819 | |
| EDTA | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2937 | |
| Formic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3858 | |
| Hepes | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3724 | |
| Magnesium chloride | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A4425 | |
| Methanol | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2954 | |
| Phosphorous acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0989 | |
| Di-Potassium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1042 | |
| Potassium di-hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1043 | |
| Sodium hydroxide | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1551 | |
| Sucrose | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1125 | |
| Tricine | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3954 | |
| Tris | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2264 | |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega website: http://www.promega.de/ |
V5111 | |
| Equipment | |||
| Neboulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 |
||
| Centrifuge tubes (14 x 89 mm) for preparation of takahashi style gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
331372 | |
| Centrifuge tubes 25 x 89 mm for preparation of thylakoid isolation gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
344058 | |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
449/72 | |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
10618242 | |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
105252220 | |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Outro | |||
| Antibodies | Agrisera website: http://www.agrisera.com/en/index.html |
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