に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup> 15</sup> N代謝標識および定量的質量分析
Summary
記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチは、異なる条件下で多タンパク質複合体の組成物への洞察を得ることを目的と遺伝的に異なる菌株を比較することによって実証される。定量分析のためにショ糖密度勾配とは異なる画分の等しい体積を質量分析によって混合し、分析する。
Abstract
導入されたプロトコルは、異なる条件下での複雑な組成物への洞察を明らかにすることによって、チラコイド膜内の多タンパク質複合体の分析のためのツールを提供しています。このプロトコルではアプローチは、遺伝的に異なる株から単離されたコナミドリムシ環状電子流（CEF）に関与するタンパク質複合体の組成を比較することによって実証される。手順は、差動代謝標識（14 N / 15 N）に基づいて、ショ糖密度勾配遠心分離、SDS-PAGE、免疫検出および比較、定量的な質量分析（MS）による多タンパク質複合体へのそれらの分離を行い、チラコイド膜の単離を含む株を分析した。洗剤可溶化したチラコイド膜は、等しいクロロフィル濃度のショ糖密度勾配にロードされます。超遠心分離後、勾配は、質量spectrometによって分析される画分に分離されるRY同体積に基づく。このアプローチは、さらに勾配画内の組成の調査と、特にANR1、CAS、およびPGRL1に焦点を当て、異なるタンパク質の移行挙動を分析することができます。さらに、この方法は、（イムノブロットの結果を確認することにより、さらに、以前の研究からの知見を支持して、以前にCEF-supercomplex例えばPGRL1、FNRなどの一部であると記載されたタンパク質の同定およびPSI-依存性遊走を示しており、 CYT F）。注目すべきことに、このアプローチは、このプロトコルを採用することができ、 例えば、異なる環境条件から単離された多タンパク質複合体組成物の比較分析のために使用される質問の広い範囲に対処するために適用可能である。
Introduction
植物や藻類のチラコイド膜での光合成のプロセスは、線状および環状モードで機能することができます。リニア電子流（LEF）の間に光化学I（PSI）、光化学系II（PSII）およびシトクロムB 6 / Fは、最終的には 、NADPHとATP 2の生成につながる、NADP + 1を水から電子を移動。対照的に、状態2 3 4及び嫌気的条件等の多様な環境条件下で誘導されることが知られている環状の電子流（CEF）は、バック電子伝達鎖に電子を注入することによって酸化PSIの再減少をもたらす。このプロセスは、チトクロームB 6 / F複合体1の間質側またはプラストキノンプール5のいずれかで行われるとATPを生成しますが、無NADPH 2することができます。
提示されたプロトコルの目的は、質量分析（MS）ベースのm個を実証することである（遺伝的に異なる株と比較することによって例示される）、さまざまな条件の下でこれらの複合体の組成物への洞察を得るためにクラミドモナスのチラコイド膜での多タンパク質複合体の比較、定量分析のためのethod。このアプローチは、寺島らによる刊行物に適用された。2012年にはC言語でのCEFののCa 2 +依存性の調節を示すクラミドモナスは、タンパク質、CAS、ANR1、およびPGRL1 6を含む多タンパク質複合体により媒介される。手順は、比較的重いことにより、標識窒素（15 N）を有する二つの株のいずれかを利用して二つ遺伝的に異なる菌株におけるCEF-supercomplexの組成を分析することによって説明される。簡単に説明すると、プロトコルは、界面活性剤可溶化し、ショ糖密度勾配における光合成複合体の分画、続いてチラコイド膜の調製を含む。勾配の分画後、FRACを選択した二つの株のtionsを混合し、等しい体積に基づいてゲル内消化およびその後の定量的MS分析に続いてSDS-PAGEによって分離されている。
上述したように、CEFは異なる環境条件の下で誘導され、2010年からの出版物は、機能的なCEF-supercomplex Cの状態2ロックされたセルからの隔離を示しています超遠心分離中にショ糖密度勾配上に可溶化されたチラコイド膜を分離することによって行われた、07 ラインハーディ 。岩井ら 7とは異なり、提示されたプロトコルは、C.成長嫌気から、CEF-supercomplexの単離を記載代替手順に従うことによって、 クラミドモナスの文化。これは、チラコイド分離プロトコルにおける変化ならびに可溶化工程及び超遠心分離によるタンパク質複合体の分離に関する差異を含む。現在のプロトコルでは、チラコイド膜バッファは、岩井らによるチラコイド調製のために使用しながら、チュアとBennoun 8によって発表された手順を適用することによって単離される文献 09記載のように、25mMのMES、0.33 Mスクロース、5mMのMgCl 2、1.5mMのNaCl液（pH6.5）を含有した。ここで説明可溶化法が0.9％の界面活性剤の使用に依存しながら可溶化は、岩井および共同研究者の場合には、氷上で30分間、0.7から0.8パーセントの界面活性剤（n-トリデシル-β-D-マルトシド）を用いて行った（nは-ドデシル-β-D-マルトシド（DM-β））と、氷上で20分間だけ実行される。両グループは、それぞれの洗剤で可溶化にミリリットルあたりのクロロフィル0.8mgのを使用していました。このプロトコルの作者が範囲の濃度を使用し、一方、可溶化したチラコイド膜からの光合成複合体を分離するための岩井ら 、0.1から1.3 mのショ糖濃度を適用0.4〜M.最後の差から比べても低い遠心分離速度は、あるEAへrlier出版。
ショ糖密度勾配分画に続いて非イオン性界面活性剤とのチラコイド膜の可溶化は、すでに1980年代から、タンパク質の代謝標識の適用はプロテオミクス分野で普及の方法で、今日7、9月14日まで、至るまで数多くの研究に適用されている。記載されたアプローチは、質量に至る全てのアミノ酸に組み込まれている15 N NH 4 Cl を 、の形の唯一の窒素源として重窒素の存在下で培養することにより、2つの比較した株のいずれかの15 N代謝標識を適用するペプチドのアミノ酸配列に応じてシフトする。 1 MSラン内の14 Nおよび15 Nの混合物を分析する場合、この質量シフトは、各ペプチドの試料の起源を決定するために使用することができ、ペプチドの相対存在量は、相当の相対存在量を表す計算することができる。タンパク質15を ING。
C上の多数の定量的プロテオミクス研究クラミドモナスは、実験条件（ 例えば 、栄養16〜19によるプロテオームの変化や光ストレス20,21）間のプロテオームの変化を分析するために、タンパク質の定義された量を比較した、利用可能です。これらの研究と比較して、現在提示アプローチにおいて試料の等容量を一緒にし、分析する。このセットアップでは、グラデーション内のタンパク質の移行挙動を研究するため、さらに調査した株に対して異なる複合体の組成を分析することができます。
このメソッドは、主に三つのタンパク質に集中して説明する。第一候補は、C.中の光馴化に関与することが示された葉緑体に局在するカルシウムセンサータンパク質のCASで、 クラミドモナス 22。カルシウムは、重要なシグナルであると考えられている最終的に遺伝子発現と細胞生理学23の変化につながるため、様々な生物的および非生物的ストレスに活性化され、それが葉緑体は、CASタンパク質22,24,25を介したシグナル伝達+携帯のCa 2に貢献するかもしれないことが提案された経路のためのイオンをING。第二のタンパク質はANR1（嫌気応答1 6）、Cで無酸素の成長条件下で誘導されることが示されたタンパク質であるクラミドモナス 26。とりわけ、CASならびにANR1はCEF-supercomplexのサブユニットとして同定され、また、逆遺伝学的ア プローチを用いて、それが両方のタンパク質が、このタンパク質複合体の機能的なサブユニットとしての役割を支持し、 インビボ 6 に CEFに機能的に寄与することが実証された。第3のタンパク質は、 クラミドモナス 4,27においてだけでなく、 シロイヌナズナ 5,28にCEFに関与することが示されており、また、IDだったチラコイド蛋白PGR5様1（PGRL1）、ある岩井らの作品にentified。7
ΔPSI29株（対）対野生型（WT）、PSAB遺伝子の欠失を示す、またの一部であるサブユニットIは本質的な光化学系をコードする：このアプローチは、2つの異なる実験の結果を示すことによって提示されるCEF-supercomplex及びWT対A pgrl1ノックアウト株は4。これらの実験のそれぞれについて、15 Nおよび14 N標識株は、比較されている間、CEF-supercomplexの定量的組成物。
Protocol
Representative Results
Discussion
安定同位体標識を用いて、異なる定量的プロテオミクス研究は、過去数年に発表されている。これらの実験では、通常、2つの異なるサンプルは、1つのサンプルが安定同位体で標識された、比較される。その後、二つの試料からのタンパク質またはペプチドは、等しい比率で組み合わされ、一緒になって、さらに48を処理した。このような研究は、多くの場合、アップまたはダウンレ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MHが「ドイツ学術振興」（DFG）からの支援を認めるものです。著者 寄付：MHが調査を設計し、KT、JSとMTは、研究を行い、データを分析し、KTとMHが論文を書いた。
Materials
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0662 | |
| Acetone | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2300 | |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
9340 | harmful, work with gloves see protocol text for further precautions |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
39466-62-1 | |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0988 | |
| Ammonium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3583 | |
| Ammonium sulfate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3598 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
10041653 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0819 | |
| EDTA | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2937 | |
| Formic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3858 | |
| Hepes | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3724 | |
| Magnesium chloride | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A4425 | |
| Methanol | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2954 | |
| Phosphorous acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0989 | |
| Di-Potassium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1042 | |
| Potassium di-hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1043 | |
| Sodium hydroxide | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1551 | |
| Sucrose | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1125 | |
| Tricine | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3954 | |
| Tris | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2264 | |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega website: http://www.promega.de/ |
V5111 | |
| Equipment | |||
| Neboulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 |
||
| Centrifuge tubes (14 x 89 mm) for preparation of takahashi style gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
331372 | |
| Centrifuge tubes 25 x 89 mm for preparation of thylakoid isolation gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
344058 | |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
449/72 | |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
10618242 | |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
105252220 | |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Outro | |||
| Antibodies | Agrisera website: http://www.agrisera.com/en/index.html |
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