التصوير خلية غشاء من الإصابات والعمليات التحت خلوية المشاركة في اصلاح
Summary
عملية الشفاء من الخلايا جرح ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة غشاء الخلية. يصف هذا البروتوكول فحوصات لرصد هذه العمليات.
Abstract
قدرة الخلايا المصابة للشفاء هو عملية الخلوية الأساسية، ولكن الآليات الخلوية والجزيئية المشاركة في خلايا الشفاء بجروح ولا يزال الغموض يكتنف. هنا يتم وصف فحوصات لرصد القدرة وحركية للشفاء من إصابة الخلايا المستزرعة التالية مترجمة. يصف البروتوكول الأول نهجا يستند إلى نقطة النهاية في وقت واحد لتقييم قدرة الخلايا إصلاح غشاء من مئات الخلايا. يصف البروتوكول الثاني نهج التصوير في الوقت الحقيقي لمراقبة حركية إصلاح غشاء الخلية في الخلايا الفردية بعد الاصابة المترجمة مع ليزر نابض. كما أصيب خلايا الشفاء ينطوي الاتجار بروتينات معينة ومقصورات التحت خلوية إلى موقع الإصابة، ويصف البروتوكول الثالث استخدام نهج نقطة النهاية أعلاه استنادا إلى تقييم واحد مثل الاتجار الحدث (الليزوزومية إيماس) في مئات من الخلايا في وقت واحد وجرح بروتوكول مشاركة يصف استخدام الليزر النبضي الإصابة جنبا إلى جنب مع صغار TIRFنسخة لرصد ديناميات مقصورات التحت خلوية الفردية في الخلايا المصابة في القرار المكانية والزمانية عالية. في حين تصف بروتوكولات هنا استخدام هذه الأساليب لدراسة العلاقة بين إصلاح غشاء الخلية وإيماس الليزوزومية في خلايا العضلات مثقف، يمكن تطبيقها على هذا النحو لأية خلية أخرى ملتصقة مثقف ومقصورة التحت خلوية من خيار.
Introduction
يحافظ على غشاء الخلية على سلامة الخلايا من خلال توفير حاجز بين الخلية والبيئة خارج الخلية. A التحفيز الكيميائية والكهربائية والميكانيكية أو التي تتجاوز عتبة فسيولوجية طبيعية وكذلك وجود غزو مسببات الأمراض يمكن لكل نتيجة في إصابة غشاء الخلية وتثير رد فعل الخلوية اللاحقة لإصلاح هذا الضرر. البقاء على قيد الحياة هذه الإصابات لغشاء الخلية، والخلايا تمتلك آلية فعالة للإصلاح. هذه الآلية هي التي تعتمد الكالسيوم وينطوي الاتجار داخل الخلايا من البروتينات مثل annexins وMG53 وغيرها فضلا عن المقصورات التحت خلوية مثل الإندوسومات، الجسيمات الحالة، جولجي والميتوكوندريا الحويصلات المشتقة من غشاء الخلية أصيب 1-7. ومع ذلك، فإن تفاصيل تسلسل الأحداث الجزيئية والتحت خلوية المشاركة في إصلاح غشاء الخلية التالفة لا تزال غير مفهومة تماما.
يمكن فصل استجابة إصلاح الخلية في الأذنلاي والاستجابات في وقت متأخر. الردود في وقت مبكر، والتي تحدث في غضون ثوان إلى دقائق النطاق الزمني، مهمة بشكل كبير في تحديد طبيعة الاستجابات في وقت متأخر مما يؤدي إلى إصلاح الخلية ناجحة أو موت الخلية. وقد ساعدت المقايسات نقطة النهاية على أساس الأكبر تحليل الكيمياء الحيوية والخلوية إثبات تورط العمليات الجزيئية والخلوية في الإصلاح. ولكن، نظرا لعدم التجانس وسرعة الاستجابة إصلاح الخلوية، تفشل المقايسات نقطة النهاية لتقديم التفاصيل الحركية والمكانية للتسلسل الأحداث التي أدت إلى إصلاح. هي مناسبة النهج التي تمكن من إصابة تسيطر غشاء الخلية وتسمح برصد إصلاح غشاء الخلية والاستجابات المرتبطة التحت خلوية في القرار المكانية والزمانية عالية مثالي لمثل هذه الدراسات. هنا، وقد عرضت هذه النهج. اثنين من البروتوكولات وصف النهج لرصد حركية في الوقت الحقيقي من إصلاح غشاء الخلية والردود التحت خلوية المرتبطة بعملية الإصلاح في الخلايا الحية التالية ينج الليزرأوروغواي. كتكملة لهذه المقايسات التصوير الخلية الحية تستند، كما تم وصفها المقايسات نقطة النهاية التي توفر مقياسا على السكان لإصلاح رصد الخلايا الفردية وردود التحت خلوية المرتبطة بها. لإثبات فائدتها وقد استخدمت هذه الأساليب لمراقبة الاتجار وإيماس من الجسيمات الحالة في استجابة لإصابة غشاء الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إصابة غشاء الخلية في الجسم الحي يحدث نتيجة لمجموعة متنوعة من الضغوطات الفيزيولوجية ولقد تم تطوير العديد من الطرق التجريبية لتقليد هذه. وتشمل هذه إصابة غشاء الخلية من الخلايا الملتصقة عن طريق كشط لهم قبالة صحن أو الركض من خلال الضيقة تتحمل حقنة 9،10. بعد هذه …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AR055686 وAR060836 وزمالة ما بعد الدكتوراه لم من قبل جمعية الضمور العضلي الفرنسية (AFM). يتم دعم مرفق التصوير الخلوية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HD040677.
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
Referências
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Blebbing confers resistance against cell lysis. Death Differ. 18, 80-89 .
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling. Cell Biol. 193, 455-464 (2011).
- Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).
- McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. Cell wound assays. Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).
- McNeil, P. L. Direct introduction of molecules into cells. Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).
- Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Benink, H. A., Bement, W. M. Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds. Cell Biol. 168, 429-439 (2005).
- Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy. Cell Biol. 149, 23-32 (2000).
- Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. 388, 474-478 (1997).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Ch. 4.12. Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).
- Jaiswal, J. K., Simon, S. M. Imaging single events at the cell membrane. Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).
