イメージング細胞膜の損傷および修復に関与する細胞内プロセス
Summary
治癒損傷した細胞の処理は細胞膜の損傷部位に特異的なタンパク質および細胞内コンパートメントの輸送を伴う。このプロトコルは、これらのプロセスを監視するためのアッセイを説明しています。
Abstract
癒すために傷ついた細胞の能力は、基本的な細胞プロセスですが、治癒損傷細胞に関与する細胞および分子メカニズムはほとんどわかっていない。ここでアッセイは、局所的な損傷後の培養細胞の治癒能力および速度を監視するために記載されている。第一のプロトコルは、同時に数百の細胞の細胞膜修復能を評価するためのエンドポイントベースの手法を記載している。第二のプロトコルは、パルスレーザによる局所的な損傷後の個々の細胞における細胞膜修復の動態をモニターするリアルタイム画像化のアプローチを記載する。治癒負傷した細胞が損傷部位に特異的なタンパク質と細胞内コンパートメントの輸送を伴うように、第3のプロトコルが同時に負傷した細胞の何百ものそのような人身売買のイベント（リソソームエキソサイトーシス）を評価するには、上記のエンドポイントベースのアプローチを使用し、最後のプロトコルについて説明TIRFのミクロスと共にパルスレーザー傷害の使用を記載高い空間分解能と時間分解能で負傷した細胞では、個々の細胞内コンパートメントのダイナミクスを監視するためのコピー。ここプロトコルは、培養筋細胞における細胞膜の修復およびリソソームのエキソサイトーシスの間のリンクを調べるため、これらのアプローチの使用を記載しているが、それらは、他の接着性の培養細胞と、選択した細胞内コンパートメントにそのまま適用することができる。
Introduction
細胞膜は、細胞と細胞外環境との間の障壁を提供することで、細胞の完全性を維持します。正常な生理的しきい値だけでなく、侵入する病原体の存在を超えて、化学的、電気的、または機械的刺激は、細胞膜への傷害におけるそれぞれの結果とは、この傷害を修復するために、その後の細胞応答を誘発することができます。細胞膜へのこれらの損傷に耐えるために、細胞を修復するための効率的なメカニズムを有する。このメカニズムは、カルシウム依存性であり、他の中のようなアネキシンやMG53のようなタンパク質の細胞内輸送だけでなく、このような怪我を細胞膜1-7エンドソーム、リソソーム、ゴルジ派生小胞やミトコンドリアなどの細胞内区画を必要とする。しかし、損傷した細胞膜の修復に関与する分子および細胞内イベントのシーケンスの詳細はよくわかっていないままです。
細胞の修復応答は、耳の中に分離され得るLY及び後期応答。分の時間スケールに数秒以内に起こる初期の応答は、成功した細胞修復または細胞死に至る後期応答の性質を決定するのに途方もなく重要である。バルク生化学的および細胞分析に基づいて、エンドポイントアッセイは、修理中の分子や細胞プロセスの関与を確立に貢献している。しかし、原因細胞修復応答の不均一性及び迅速性のために、エンドポイントアッセイは、修理に至る一連の事象の運動および空間の詳細を提供することができない。細胞膜の制御された傷害を有効にして、細胞膜の修復と高い空間分解能と時間分解能で、関連する細胞内応答を監視できるようなアプローチは、理想的には、そのような研究に適しています。ここで、そのようなアプローチが提示されている。プロトコルの二つは、細胞膜修復のリアルタイム動態およびレーザinjの次の生細胞における修復過程に関連付けられている細胞内応答をモニターするためのアプローチを記載ユリィ。これらの生細胞イメージングに基づくアッセイを補完するものとして、エンドポイントアッセイはまた、個々の細胞および関連する細胞内応答のモニタリング修復のための集団ベースの測定を提供するが記載されている。これらのアプローチは、細胞膜の損傷に応答して輸送およびリソソームのエキソサイトーシスをモニターするために使用されているそれらの有用性を実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
インビボでの細胞膜傷害は、これらを模倣するために開発された生理学的ストレスおよびいくつかの実験的アプローチの種々発生する。これらの皿を、それらを掻き落としたり、狭い穴の注射器9,10を通じて継代することにより接着細胞の細胞膜を傷つけています。このような傷害後の細胞を懸濁液で治癒し、それらが正常組織中でそうであるように、細胞外マトリックスに接…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フランスの筋ジストロフィー協会（AFM）によるADに健康補助金AR055686とAR060836およびポスドクの国立研究所によってサポートされていました。本研究で利用される細胞イメージング施設は、健康補助金HD040677の国立研究所によってサポートされています。
Materials
| HBSS | Sigma | H1387 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| HEPES | Fisher | BP410 | Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4) |
| FITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1820 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| Glass beads | Sigma | G8772 | |
| TRITC dextran (Lysine fixable) | Invitrogen | D1818 | 2 mg/ml in CIM or PBS |
| PFA 16% | EMS | 15710 | 4% in PBS |
| Hoechst | Invitrogen | H3570 | 1/10 000 in PBS |
| FM dye | Invitrogen | T3163 | 1 µg/µl in CIM or PBS |
| FITC dextran | Sigma | FD40S | 2 mg/ml in growth medium |
| LAMP1 | Santa Cruz | sc-19992 | 1/300 in growth medium |
| Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG | Invitrogen | A21470 | 1/500 in blocking solution |
| Mounting media | Dako | S3023 | |
| Coverslips | Fisher | 12-545-86 | |
| Glass bottom petridish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Silicone O ring | Bellco | 1943-33315 | |
| Coverslip holder | Bellco | 1943-11111 | |
| Invitrogen | A-7816 | ||
| DMEM | VWR | 12001-566 | |
| FBS | VWR | MP1400-500H | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Penicillin/Sreptomycin | VWR | 12001-350 | Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | 5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining |
| PBS (Ca2+ and Mg2+ free) | VWR | 12001-664 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus America, PA | IX81 | |
| TIRF illuminator | Olympus America, PA | Cell^TIRF (IEC60825-1:2007) | |
| Epifluorescence illuminator | Sutter Instruments, Novato CA | Lambda DG-4 (DG-4 30) | |
| CCD Camera | Photometrics, Tucson, AZ | Evolve 512 EMCCD | |
| Image acquisition and anaysis software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Slidebook 5 | |
| Pulsed laser | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO | Ablate (3iL13) | |
| Stage top incubator | Tokaihit, Japan | INUBG2ASFP-ZILCS |
Referências
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