Conoscenza della composizione del floema nonché il meccanismo del suo carico e trasporto a lunga distanza è essenziale per la comprensione della segnalazione a lunga distanza in sviluppo delle piante e di stress / risposta patogeno e di assimilare trasporto. Questo manoscritto descrive la raccolta di essudati floema con il metodo EDTA-agevolata.
Il floema impianto è essenziale per il trasporto a lunga distanza di (foto-) assimila nonché della trasmissione di segnali di stress biotici e abiotici. Esso contiene zuccheri, amminoacidi, proteine, lipidi, RNA e altri metaboliti. Mentre vi è un grande interesse per la comprensione della composizione e la funzione del floema, il ruolo di molte di queste molecole e, quindi, la loro importanza nella sviluppo delle piante e di stress risposta deve ancora essere determinato. Una barriera di analisi floema risiede nel fatto che i sigilli stesso floema upon ferendone. Come risultato, il numero di piante da cui floema può essere ottenuta è limitata. Un metodo che consente la raccolta di floema essudati da diverse specie di piante, senza attrezzature aggiunto è la collezione di EDTA-agevolata floema essudato qui descritto. Mentre è facile da usare, consentono di giungere alla ferimento di cellule e la cura deve essere presa per rimuovere contenuto delle cellule danneggiate. Inoltre, diversi controlli per dimostrare la purezza dell'essudatosono necessari. Perché è un essudato piuttosto che una raccolta diretta del floema (non possibile in molte specie) soltanto quantificazione relativa dei suoi contenuti può verificarsi. Il vantaggio di questo metodo rispetto ad altri è che può essere usato in molti erbacea o specie di piante legnose (Perilla, Arabidopsis, pioppo, ecc) e richiede un minimo di attrezzature e formazione. Si porta a ragionevolmente grandi quantità di essudati che possono essere utilizzati per la successiva analisi di proteine, zuccheri, lipidi, RNA, virus e metaboliti. È abbastanza semplice che può essere utilizzato sia in una ricerca così come in un laboratorio didattico.
Piante non possono muoversi per sfuggire condizioni avverse. Di conseguenza, hanno dovuto sviluppare meccanismi per rilevare stress ambientali, suscitare e trasmettere un segnale correlato in tutta la pianta, e di regolare di conseguenza lo sviluppo. Esistono due sistemi di trasporto per la distribuzione di acqua, i nutrienti e altri composti (segnalamento). Il primo è lo xilema; quali trasporta tipicamente acqua e sali minerali assorbiti dalle radici tutto l'impianto. Il secondo è il floema. La vista del floema è cambiata da un semplice sistema di trasporto assimilare ad un condotto per l'RNA, proteine, virus, lipidi e altre piccole molecole. Esso gioca un ruolo importante nel assimilare e trasporto di nutrienti, risposta allo stress biotico e abiotico, così come in crescita e sviluppo delle piante. Si è ora chiamato il "autostrade dell'informazione" della pianta 18.
Floema è composto da diversi tipi di cellule: floema parenchima, nonché compagna specializzato ceLLS ed elementi di Sieve. L'elemento setaccio è il sito di movimento a lunga distanza. Per consentire il flusso longitudinale ostruito, elementi forati mancano maggior organelli nonché nuclei e si pensa di contenere al massimo un macchinario traduzionale limitata 21, 33. Si ritiene che le cellule compagno sintetizzare le proteine e altri composti, che viaggiano nel flusso floema. Questi composti vengono poi trasportati nell'elemento setaccio attraverso plasmodesmata e può funzionare come segnali lunga distanza 4,16.
Diversi gruppi di composti possono essere trovati in floema essudati:
La sfida nel lavorare con floema impianto risiede nella sua capacità di sigillare su di sé ferimento. Ci sono quattro metodi principali utilizzati per raccogliere floema essudati, eppure essi funzionano solo in alcune specie:
1) In cucurbitacee è possibile ottenere quantità ragionevole di floema essudato attraverso tagli del picciolo. Una volta che la goccia iniziale con contaminazione delle cellule danneggiate viene rimosso, è possibile avere ragionevolmente grandi quantità di pura floema 1, 15. Tuttavia, con l'aumento del tempo di raccolta, questo essudato addensa, rendendo sempre più inadatto per approcci di cromatografia liquida (non pubblicato). Pubblicazioni recenti suggeriscono, che a seconda della specie, tale floema è derivato da either il fascicolare (FP) o il extrafascicular floema (EP) e che, mentre lo fa contenere "mobile" floema linfa dagli elementi Sieve (FP), è anche incline alla contaminazione da altri tipi di cellule, tra cui lo xilema 40, 41 .
2) Un secondo approccio è quello di ottenere floema linfa attraverso tagli poco profondi o forature a gambo o picciolo. Questo metodo è stato utilizzato con successo in lupino 17, 25, 36 cucurbitacee, e Brassica napus 12. Qui la contaminazione da cellule danneggiate è minimo e il essudati molto puro. Tuttavia, le piante hanno bisogno per essere sani e ben irrigata dal momento che è molto difficile da perforare selettivamente solo gli elementi setaccio. Se vasi dello xilema sono intaccate tutti essudato viene disegnato nel flusso xilema. Ciò rende il metodo adatto per impianti con piccioli o gambi molto fragili o fortemente lignificato.
3) Afide stylectomy afidi permette di inserire il loro stiletto negli elementi setaccio l'n rimuovendo l'afide con un laser. Floema è trasudava attraverso il rimanente mandrino 2, 9, 10, 35, 38. In teoria, ogni pianta che può essere infettata da afidi può essere utilizzato per questo approccio. Tuttavia, la maggior serra o gestori di camera di crescita non supportano l'uso di un agente patogeno. Inoltre, afidi introducono diverse proteine nel floema con la loro saliva 19, 33. Questo porta ad una limitata trascrizionale riprogrammazione 30 e ha il potenziale per cambiare la composizione floema 26.
4) Il metodo descritto qui è l'essudazione EDTA-agevolata del floema. Questo metodo impiega EDTA per impedire tenuta del floema 20. EDTA chela Ca 2 + ioni che altrimenti partecipare ai processi che sigillano il floema. Mentre EDTA può portare a danni delle cellule 30, diversi gruppi hanno usato questo metodo e osservato alcun effetto negativo delle concentrazioni di EDTA da 10 mm a 20 mm sul ultrastruttura cellulare o su phloem di carico e di trasporto 5, 24. Per ridurre qualsiasi effetto dannoso come pure le interferenze di EDTA con cromatografia e elettroforesi su gel, piante vengono spostati in acqua dopo 1 ora e solo la parte successiva del essudato viene utilizzato 14. Così, invece di essudazione in EDTA, floema viene essudata in acqua (essudazione EDTA-agevolata). E 'un metodo straight-forward, a basso costo, e low-tech per la raccolta di floema essudati. Floema così ottenuto può essere utilizzato per analizzare le proteine, piccole molecole, lipidi, e RNA ed è stato usato con successo in molte piante. Mentre una quantità limitata di esperimenti è stata eseguita in monocotiledoni 11, il metodo sembra essere più adatto per dicotiledoni (perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, pioppo 7). Raccolta di essudati deve avvenire in un ambiente umido per evitare la perdita di essudati attraverso la traspirazione. Seconda della pianta, incubazione in EDTA per una o due ore èsufficiente a prevenire sigillatura degli elementi floema / setaccio. La raccolta può quindi verificarsi in acqua. Questo ha il vantaggio di evitare l'effetto negativo EDTA ha sulla struttura cellulare e stabilità. Inoltre elimina l'interferenza di EDTA con metodi quali HPLC o SDS-PAGE. È mostrato come si applica a Arabidopsis. Per impianti più grandi, l'incubazione in collezioni EDTA e essudato deve essere scalati e viene eseguita in bicchieri piuttosto che in 1,7 ml provette di reazione.
La collezione di EDTA-agevolata di floema essudati è molto semplice, ha bisogno di attrezzatura minima, ed è applicabile alla maggior parte delle piante. In generale, questo metodo estende la capacità di analizzare essudati floema da più specie. Benchè l'essudato viene diluito, è facile raccogliere molti campioni differenti o da molte piante a scalare fino ad una grande quantità di materiale. Questo quindi permette l'individuazione di nuovi composti che si trovano in abbondanza molto basso e sarebbero altrimenti trascurati.
Questo metodo può essere utilizzato per più specie vegetali e lavora come descritto per quelli elencati in questo manoscritto. Se nuove specie vengono esplorati, i due aspetti che potrebbero aver bisogno di modifiche sono il numero di fogli utilizzati e il tempo di essudazione. Nella maggior parte dei casi, un cinque a otto ore essudazione dovrebbe essere adatto. Per confermare l'uso di questo metodo per una nuova specie vegetali, essudato devono essere raccolte e una o più delle successive analisi come descritto nella parte 4 del protocollo needs da eseguire. A seconda dell'intensità del segnale osservato, il volume di raccolta può essere necessario scalati. In generale, l'analisi dei lipidi e delle proteine si richiedono più materiale di analisi dello zucchero e del metabolita in quanto i primi sono meno abbondanti nel floema essudati.
Perché la raccolta essudato EDTA-facilitato coinvolge superfici tagliate e anche un effetto potenzialmente dannoso di EDTA, diversi punti devono essere considerati: (1) dopo un ora di incubazione con EDTA, piccioli devono essere lavati accuratamente. Questo rimuove qualsiasi composto ottenuto da cellule feriti nonché l'EDTA stessa, che potrebbe danneggiare le cellule o interferire con l'estrazione. (2) I controlli positivi e negativi devono essere inclusi per garantire che i dati ottenuti sono derivati da floema e non da cellule danneggiate (vedi i punti critici di seguito). (3) Floema linfa contiene numerosi enzimi, che potrebbe essere attivo durante la raccolta di essudato. Quindi, in alcuni casi può essere utile raccogliere for diverse quantità di tempo. (4) Dato che il metodo coinvolto essudazione in acqua, una quantificazione assoluta dei composti non è possibile.
Passaggi critici: la chiave per il successo nell'uso di questo metodo è l'uso di cautela durante la manipolazione del campione per non ferire eventuali cellule così come l'uso di controlli appropriati (vedi rif 14.). Un controllo adeguato è la raccolta di floema essudati senza precedente trattamento con EDTA. In questo caso il floema sigillerà stessa e nessun essudato può essere raccolto. Qualsiasi composto contaminanti provenienti dalle cellule feriti vengono rilevate qui. Un secondo controllo sarebbe l'analisi degli zuccheri nel essudato. In Arabidopsis, saccarosio dovrebbe essere il metabolita predominante all'interno del floema, con fruttosio al saccarosio rapporto di 1:04-01:08 (rif 8, 14).
Per l'estrazione di RNA è necessario l'uso di un inibitore RNAsi. Inoltre, un controllo positivo di precedenza descried mRNA floema-localizzato (UBC9: Ubiquitin enzima conjugating 9, At4g27960, 8, 14) e un controllo negativo di per esempio un mRNA cloroplasto (Rubisco LSU) sono consigliabili.
Poiché l'essudato contiene enzimi attivi, un corso di tempo si consiglia di assicurarsi cambiamenti nel profilo floema non sono semplicemente dovute a variazioni nel tempo di raccolta. In alcuni casi, può essere vantaggioso utilizzare inibitori della proteinasi. Tuttavia, i ricercatori hanno bisogno di tenere a mente, che l'essudato raccolto sarà concentrata e che eventuali composti aggiunti saranno in gran parte concentrati. Un secondo punto critico all'interno del protocollo è il recutting del picciolo con EDTA. Questo passo ha un duplice scopo: in primo luogo, esso rimuove tutti piatti forati sigillati, evitando la formazione di nuove spine permettendo così il libero flusso del floema. Secondo, rimuove la bolla di cavitazione nel xilema generato durante il taglio e quindi permette il trasporto xilema. Le dimensioni del secondo taglio dipendonos sulle piante utilizzate. In impianti con piccioli più grandi dovrebbe essere più millimetri (fino a 1 cm) sopra il primo taglio, in piante come Arabidopsis, 1-2 mm sono sufficienti.
L'uso di questo metodo può portare alla scoperta di nuovi composti in essudati floema che potrebbe avere la segnalazione, implicazioni sviluppo o biomedico. E ha spinto un più sguardo in profondità alle segnalazione di lipidi a lunga distanza, che era un campo poco studiato nella scienza pianta a causa della mancanza di accesso al floema.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation concessione NSF-IOS # 1144391 per SHB.
K2-EDTA | Sigma-Aldrich | ED2P-500G | |
Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm) | PYREX or Corning | Any clean, shallow dish will work | |
Chloroform | EMD | CX1054-1 | Only open containers in fume hood |
Methanol | J.T.Baker | 9070-03 | |
Screw cap tubes | VWR International | 53283-800 | |
Screw cap tubes | Sun Sri | 13-425 | |
Eppendorf tubes | Denville | C2170 |