En mikroskopisk fenotypisk analys för kvantifiering av intracellulär mykobakteri anpassad för screening med högt genomströmning/högt innehåll
Summary
Här beskriver vi en fenotypisk analys som är tillämplig på höggenomströmning / höginnehållsskärmar av små-störande syntetiskt RNA (siRNA), kemisk förening och Mycobacterium tuberculosis mutant bibliotek. Denna metod förlitar sig på detektion av fluorescerande märkt Mycobacterium tuberkulos inom fluorescerande märkt värdcell med hjälp av automatiserad confocal mikroskopi.
Abstract
Trots tillgången till terapi och vaccin är tuberkulos fortfarande en av de dödligaste och mest utbredda bakterieinfektionerna i världen. Sedan flera decennier är den plötsliga sprängningen av multi- och omfattande läkemedelsresistenta stammar ett allvarligt hot mot kontrollen av tuberkulos. Därför är det viktigt att identifiera nya mål och vägar som är kritiska för tuberkulosens orsaksmedel, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) och att söka efter nya kemikalier som kan bli tbc-läkemedel. Ett tillvägagångssätt är att sätta upp metoder som är lämpliga för genetiska och kemiska skärmar i storskaliga bibliotek som möjliggör sökning av en nål i en höstack. För detta ändamål utvecklade vi en fenotypisk analys som förlitar sig på detektion av fluorescerande märkt Mtb inom fluorescerande märkta värdceller med hjälp av automatiserad konfokal mikroskopi. Denna in vitro-analys möjliggör en bildbaserad kvantifiering av koloniseringsprocessen av Mtb i värden och optimerades för 384-brunns microplate-formatet, vilket är lämpligt för skärmar av siRNA-, kemisk förening- eller Mtb-mutantbibliotek. Bilderna bearbetas sedan för multiparametrisk analys, vilket ger läs upp härdning på patogenesen vid Mtb i värdceller.
Introduction
Bland de framväxande och nya infektionspatogener som rapporterats under de senaste åren har Mycobacterium tuberculosis (Mtb) en framträdande plats som ansvarar för 1,4 miljoner dödsfall och 8,7 miljoner nya infektioner 2011 (Global tuberkulosrapport 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Trots tillgången till multiresistenta behandlingar ökar fortfarande antalet smittade och multiresistenta (MDR) samt omfattande läkemedelsresistenta (XDR) Mtb sprider sig snabbt över hela världen1. Dessutom, när man tar hänsyn till förekomsten av Mtb-antigener, är det uppenbart att en tredjedel av den globala befolkningen anses vara latent infekterad av Mtb. Statistiskt sett, i ett fall av tio, finns det utveckling mot den aktiva formen av sjukdomen med efterföljande kliniska symtom2. Därför finns det ett trängande behov av nya medel för att bekämpa Mtb. I detta sammanhang utvecklade vi en in vitro visuell fenotypisk analys som förlitar sig på övervakning av Mtb invasion och multiplikation i värdceller av automatiserad confocal fluorescensmikroskopi3. Anpassningen av analysen i 384-brunns mikrotiterplattor i kombination med automatiserad bildförvärv och analys tillät screening med högt innehåll/hög genomströmning (HC/HTS) av medelstora bibliotek av föreningar, siRNAs och bakteriella mutanter. Screeningen av ett genomomfattande RNAi-bibliotek på denna fenotypiska analys möjliggjorde således identifieringen av de viktigaste värdfaktorerna som är involverade i Mtb-handel och intracellulär replikering men också klarering av värdvägar som utnyttjas av tuberkelbacilillus. En annan anpassning av denna särskilda fenotypiska analys var för identifiering av bakteriella faktorer som är väsentliga för Mtb intra-phagosomal persistens. Till exempel anses gripandet av fagolik mognad som en av de viktigaste mekanismerna som underlättar överlevnad och replikering av Mtb i makrofag. Övervakning av subcellulär lokalisering av Mtb knockout mutanter i fluorescerande märkta-sura fack tillåtna för identifiering av bakteriella gener som är involverade i överlevnadsprocessen4. Slutligen erbjuder den högkvalitativa avbildningen av Mtb också en utmärkt metod för att kvantifiera läkemedelseffektivitet för att hämma olika fenomen som intracellulär bakterietillväxt3. Sammantaget möjliggör denna typ av fenotypisk analys med hög genomströmning accelererande läkemedelsupptäckt mot tbc och de data som samlas in av dessa olika metoder bidrar till en bättre förståelse av värdmanipulationen som utövas av Mtb.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver här de metoder som krävs för en fenotypisk analys med hjälp av en GFP-uttrycker Mtb H37Rv stam att infektera fluorescerande märkta värdceller, vilket gör det lämpligt för hög innehåll / hög genomströmning skärmar. Detta protokoll kan tillämpas på ett brett spektrum av föreningar, fluorescerande sonder och Mtb mutanter. För varje protokoll som beskrivs ovan kan fixerings- och immunolabelingsteg utföras före bildförvärv. Vi använder ett automatiserat fluorescerande konf…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ekonomiskt stöd till detta arbete tillhandahölls av Europeiska gemenskapen (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) och Regionen Nord Pas de Calais. Vi erkänner tacksamt den tekniska hjälpen från Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni och Frank Lafont från plattformen BICeL.
Materials
| µclear-plate black, 384 well | Greiner bio-one | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384 well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white , 384 well-plate | Greiner bio-one | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1X [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1X [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| FICOLL PAQUE PLUS | DUTSCHER | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1X | Life Technologies | 15040033 | Non enzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Non targeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfert, storage and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
Referências
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
