Utilisation de protéines fluorescentes de visualiser et de quantifier<em> Chlamydia</em> Vacuole la dynamique de croissance dans les cellules vivantes

Summary

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Abstract

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C. trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium’s ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Introduction

Les maladies infectieuses causées par des espèces de la bactérie Chlamydia intracellulaire suscitent un fardeau important sur ​​la santé mondiale, y compris les maladies sexuellement transmissibles, la maladie inflammatoire pelvienne, la cécité, la pneumonie et, éventuellement, l'athérosclérose ^1-4. La capacité de Chlamydia d'interagir avec la cellule hôte, à partir de l'intérieur d'une vacuole (appelée inclusion), est un facteur déterminant de leur infection réussie de cellules et de l'hôte. L'inclusion est un compartiment pathogène roman qui permet la croissance de la chlamydia et est modifié dynamiquement tout au long du cycle de développement 2-3 jours de Chlamydia ^5. La nature intracellulaire obligatoire de Chlamydia présente de nombreux défis à la communauté de la recherche, en particulier pour étudier directement la biologie unique de l'inclusion. Un handicap majeur a été l'incapacité de visualiser efficacement soit Chlamydia intracellulaire ou leur inclusion par l'approche fluorescentees dans les cellules vivantes. Une découverte récente a finalement révélé les moyens de générer exprimant la GFP C. ⁶ trachomatis; Toutefois, cette constatation n'a pas encore abouti à un étiquetage spécifique de l'inclusion. Certaines techniques ont été décrites pour l'étiquetage des bactéries et des inclusions ^7,8, mais ils souffrent de lacunes tels que la non-spécificité, l'éphémère et la susceptibilité à photoblanchiment. Une découverte clé de notre groupe a établi une nouvelle stratégie pour éclairer l'inclusion en utilisant exprimant la GFP cellules hôtes ^9. Cette stratégie exploite rationnellement l'imperméabilité intrinsèque de la membrane de l'inclusion de molécules supérieur à ¹⁰ 520 Da. Lorsque les cellules sont manipulées pour exprimer de façon stable une protéine fluorescente cytosolique particulier (par exemple, la GFP ou mCherry), inclusions à Chlamydia sont visibles avec une clarté remarquable par leur exclusion complète de la fluorescence. Cette stratégie d'imagerie inverse permet la visualisation immédiate des inclusions pour tous Chlespèces amydia et il peut être facilement adaptés pour la plupart des cellules hôtes d'intérêt. Comme une démonstration de son utilité, cette méthode a été utilisée précédemment pour révéler et de définir les voies de sortie cellulaires pour Chlamydia spp ^9.

Ici, nous démontrons encore comment cette méthode est effectuée, et peut être exploitée pour obtenir des données quantitatives clés sur la dynamique de croissance de l'inclusion. En outre, il peut effectivement se substituer aux méthodes de dénombrement à base d'anticorps coûteux et peut être utilisé en tandem avec d'autres marqueurs fluorescents, comme mKate2 exprimant Chlamydia ^11. Cette puissante combinaison d'outils permet l'exploration des propriétés physiques de la membrane de l'inclusion Chlamydia intérieur des cellules hôtes de vie.

Protocol

1. Génération de lignées cellulaires hôtes Fluorescent Jour 1. Plate cellules 293T (ou autre ligne d'emballage retroviral) sur des plaques à 6 puits à 2 x 10 6 cellules / puits, à ~ 75% de confluence le lendemain. Si on le souhaite, la plaque de puits en double pour chaque rétrovirus à être utilisés. Jour 2. Aspirer cellules et ajouter 2 ml de milieu de croissance frais (DMEM + 10% de FBS + 2 mM de L-glutamine). Transfecter des cellules avec 5-8 ug de chaque vecteur retrovi…

Representative Results

Les cellules de mammifères exprimant des protéines cytosoliques fluorescents (par exemple, GFP) peuvent être conçus pour permettre un éclairage d'inclusions à Chlamydia, dans des cultures de cellules infectées vivantes. Lors de l'infection à Chlamydia, les inclusions sont facilement visibles sous forme de taches noires dans les cellules hôtes (figure 1). La clarté des inclusions de fluorescence manque peut être exploitée pour l'identification automatiqu…

Discussion

Nous décrivons ici la stratégie expérimentale pour générer des cellules hôtes fluorescents pour de vrai visualisation et l'analyse des inclusions de Chlamydia temps. Cette approche vacuole de visualisation confère la capacité puissante pour éclairer, de suivre et de mesurer quantitativement les propriétés dynamiques des inclusions à Chlamydia dans les populations de cellules ou dans des cellules individuelles au fil du temps. Inclusions de Chlamydia dans les cellules de protéine marqu?…

Materials

Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
Polybrene	Sigma	H9268
0.45 µm filters	Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640 w/o phenol red	Cellgro	17-105-CV
Penicillin G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
Glass bottom dishes	MatTek	P35G-1.5-14-C
Chamber slides, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534