Neisseria meningitidis er en human spesifikt patogen som infiserer blodkar. I denne protokollen menneskelige microvessels er innført i en mus ved å pode menneskelig hud på immunkompromitterte mus. Bakterier holder seg i stor grad til de menneskelige fartøy, som fører til vaskulære skader og utvikling av purpura utslett vanligvis observert i humane tilfeller.
Neisseria meningitidis forårsaker en alvorlig, ofte dødelig sepsis når den kommer inn i menneskets blodstrømmen. Infeksjon fører til omfattende skader på blodårene som fører til vaskulær lekkasje, utvikling av purpura utslett og eventuell vevsnekrose. Studerer patogenesen av denne infeksjonen ble tidligere begrenset av human spesifisiteten av bakterier, noe som gjør in vivo-modeller vanskelig. I denne protokollen, beskriver vi en humanisert modell for denne infeksjonen der menneskelig hud, som inneholder dermal microvessels, er podet inn immunsupprimerte mus. Disse fartøyene anastomoserer med musen sirkulasjon og samtidig opprettholde sine menneskelige egenskaper. Når introdusert i denne modellen, N. meningitidis holder seg utelukkende til de humane fartøy, noe som resulterer i omfattende vaskulære skader, inflammasjon og i noen tilfeller utvikling av purpura utslett. Denne protokollen beskriver pode, infeksjon og evaluerings trinn av denne modellen i context av N. meningitidis infeksjon. Teknikken kan anvendes på tallrike humane spesifikke patogener som infiserer i blodstrømmen.
Meningokokk sepsis er en ofte dødelig blod født infeksjon forårsaket av bakteriell patogen Neisseria meningitidis. Meningokokk sepsis pasienter ofte har en petekkial eller purpura utslett på huden deres som tidligere har vært assosiert med vaskulær ødeleggelser forårsaket av sirkulerende bakterier og bakterielle produkter en. Hud biopsier fra kliniske pasienter viser bakterier assosiert med microvessels, ofte fylle skipene to. Bortsett fra bakterier, omfattende trombose, koagulering, lunger og vaskulær lekkasje er sett i purpura regionene 3-5. Denne vaskulære skader kan føre til utstrakt nekrose på huden og omkringliggende vev, noe som resulterer i debridement og selv amputasjon i meningokokk overlevende. Forstå hvordan infeksjonen forårsaker denne vaskulære skader er viktig å optimalisere forebygging og behandling strategier. Flertallet av forskning på meningokokk sepsis har blitt utført in vitro påhumane cellelinjer på grunn av den menneskelige spesifisiteten av N. meningitidis. Mange sider ved infeksjon har blitt studert in vitro, inkludert bakteriell adhesjon, vertscellerespons, så vel som cytokin response 6-9. Type IV pili (Tfp) har vært innblandet som den store vedheft organeller for N. meningitidis både epitel-og endotelceller 10. Det har også blitt vist at adhesjonen av N. meningitidis til vertsceller er skjærspenning avhengig og er derfor antatt å være relatert til blodstrømningsrater i microvasculature 11. Dette tyder på de dynamiske påkjenninger bakteriene møter in vivo er avgjørende for patogenesen. Det er imidlertid svært vanskelig å modellere mikromiljøet av små fartøyer in vitro.
Adhesjonen reseptor for Neisseria Tfp er fortsatt ukjent og derfor slag strategier for å oppnå bakteriell adhesjon i en dyremodell, kan ikke tenkes på dette tidspunktet. CD46 ble foreslått å være Tfp reseptoren og transgene dyr ble produsert for å fungere som musemodeller. Imidlertid, infeksjon hos disse dyrene ikke føre til omfattende infeksjon eller utslett utvikling 12,13. Andre dyremodeller som har blitt beskrevet for bakteriemi aspekt av Neisseria infeksjon ta hensyn til den bakterie preferanse for human transferrin som en jernkilde 14,15. Enten supplere menneskelige transferrin eller uttrykke det fra et transgen medfører økt bakteriemengde i blodet over en lengre tidsperiode, men denne modellen viser ingen bakteriell adhesjon eller utslett utvikling 16,17.
I denne protokollen, beskriver vi en humanisert musemodell hvor menneskelig hud, inkludert dermal microvasculature, er transplantert inn immunsupprimerte mus 18,19. Dette resulterer i funksjonelle menneskelige fartøy, perfusert med musen sirkulasjon. Kombinert med humant transferrin tilskudd, dette mOdel står for minst to av de menneskelige spesifikke aspekter av N. meningitidis, dvs. human endotel-og human transferrin, i et in vivo miljø. N. meningitidis innført intravenøst i denne modellen holder seg spesifikt til human endotel, som produserer en patologi som ligner det som er rapportert i kliniske pasienter, bl.a. vaskulære skader og purpura utslett utvikling 18..
Dyremodeller er kritisk viktig å bakteriell patogenesen forskning. Det er umulig å fullt ut etterligne in vivo miljøet i cellekultur, og det blir tydelig at host-patogen interaksjon er påvirket av mange dynamiske faktorer. Den menneskelige spesifisiteten av noen klinisk viktige patogener, som for eksempel N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, og Salmonella typhi har begrenset bruken av in vivo-modeller for slike infeksjoner. Men, som vi begynner å forstå hvilke smittsomme trinn er involvert i spesifisitet, humanisert modeller er under utvikling. Protokollen er beskrevet her er en demonstrasjon av dette med innføringen av menneskelige microvessels i mus, noe som åpner for omfattende in vivo infeksjon med N. meningitidis, noe som resulterer i vaskulær skade og noen ganger utviklingen av purpura utslett.
Ved hjelp av denne modellen,Vi har vært i stand til å definere det klebende egenskaper Tfp er involvert i vaskulære kolonisering in vivo ved hjelp av bakterie-mutanter, og at den vaskulære skade er redusert i fravær av adhesjon 18. Tidligere har sirkulert bakterielle produkter vært innblandet i denne skaden, men våre resultater tyder på en avgjørende rolle for lokale vedheft og vaskulær kolonisering. Dette åpner nye muligheter for utvikling av nye behandlingsmålene. Hvis vedheft av sykdomsfremkallende bakterier kan bli blokkert farmasøytisk det kunne hindre utvikling av dermal lesjoner og føre til bedre resultater for meningokokk overlevende i form av vevsnekrose, debridement og amputasjoner. Arbeidet har også demonstrert kompleksiteten av infeksjonen og involvering av immunrespons og koagulasjonskaskaden. Vi identifiserte humant cytokin signalering i serum hos infiserte mus til tross for den relativt lille mengde av human endotel tilstede 18..Dette indikerte en signifikant cytokin reaksjon, sammen med infiltrasjon av museimmuncellepopulasjoner inn i området.
Dyremodeller kan selvsagt aldri fullt gjenskape menneskelig sykdom og alle resultatene fått fra dem må vurderes med dette i tankene. For eksempel, i denne modellen blodet og sirkulerende celler er av mus opprinnelse, og vi kan ikke bort fra at de kan oppføre seg annerledes enn menneskeceller. En fordel med dette er imidlertid, som vist i våre nylig publikasjon 18, er evnen til å skille signalnettverk som stammer fra human endotel fra det av de sirkulerende museceller. Den immunkompromittert bakgrunn av musene som brukes i denne modellen vil også gi rom for allogenic overføring av menneskelige immuncellepopulasjoner, og legger et ytterligere "menneskeliggjøring" aspektet. Den immunkompromittert bakgrunn av musene kan imidlertid maskere en rolle for NK, T eller B-celler, som alle mangler eller defekte i denne modellen. Den relativt Short tidsramme (24 timer) som brukes i denne modellen gjelder i hovedsak medfødt respons, men for langsiktige infeksjoner og utvikling av immunitet andre alternativer må kanskje bli utforsket.
Huden er et viktig område for infeksjon N. meningitidis, men med en relativt liten mengde av humane fartøy innebærer også at ekstrapolere data til en systemisk infeksjon som involverer en rekke organer er vanskelig. Selv om denne modellen gjør det mulig for studiet av dermal lesjon utvikling, er viktige skritt av meningokokkinfeksjon som epithelial og blod-hjerne-krysset ikke inkludert. En videre utvikling av disse humaniserte modellene er nødvendig for å løse disse andre aspekter av infeksjonen. Likevel er dette modellen tilbyr et stort potensial for mange menneskelige spesifikke patogener, særlig rettet mot blodkar.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke alle medlemmer av Dumenil lab, spesielt Silke Silva for kritisk lesing av manuskriptet. I operasjonsavdelingen ved Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin og Dr. Patrick Bruneval, Patologiavdelingenn på HEGP. Dyret anlegget på PARCC, ledet av Elizabeth Huc. Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskuddsordninger etater: Marie Curie IEF fellesskap nei. 273223 (KM), ATIP-Avenir Grant fra INSERM, CODDIM utstyrsstipend (Ile de France-regionen), FRM (Fondation pour la recherche Medicale) utstyrsstipend, den IBEID Laboratory of excellence konsortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) stipend " Bugs-i-flow ". Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
(Rompun 2%) | |||
Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
Lacrigel | |||
Tronothane | Lisa Pharma | ||
GC agar Base | Conda | 1106 | |
Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
OCT tissue tek | Sakura | 4583 |