Um método de precipitação de modificação para isolar exossomas urinária

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo para isolar exossomos da urina humana usando uma técnica de precipitação modificada.

Resumo

A identificação de biomarcadores que permitem a detecção precoce de doenças renais na urina e no plasma tem sido uma área de interesse ativo há vários anos. As vesículas do exossomo urinário, com 40-100 nm de tamanho, são liberadas na urina em condições normais por células de todos os segmentos de néfrons e podem conter proteínas, mRNA e microRNA representativos de seu tipo de célula de origem. Em condições de disfunção ou lesão renal, os exossomos podem conter proporções alteradas desses componentes, que podem servir como biomarcadores para a doença. Atualmente, existem vários métodos disponíveis para isolamento de exossomos urinários, e já realizamos uma comparação experimental de cada uma dessas abordagens, incluindo três baseadas em ultracentrifugação, uma usando um concentrador de ultrafiltração de nanomembrana, uma usando um reagente de precipitação comercial e uma usando uma modificação da técnica de precipitação usando o reagente ExoQuick que desenvolvemos em nosso laboratório. Descobrimos que o método de precipitação modificado produziu o maior rendimento de partículas de exossomos, miRNA e mRNA, tornando essa abordagem adequada para o isolamento de exossomos para perfis de RNA subsequentes. Concluímos que o método de precipitação de exossomos modificado oferece uma alternativa rápida, escalável e eficaz para o isolamento de exossomos da urina. Neste relatório, descrevemos nossa técnica de precipitação modificada usando o reagente ExoQuick para isolar exossomos da urina humana.

Introdução

Exosomes urinário são pequenas vesículas internas de 100 nm de corpos multivesiculares (MVB) derivados de todos os tipos de células em condições normais e patológicas no espaço urinário incluindo podocytes glomerular, células tubulares renais e células que revestem os sistemas de drenagem urinária que parecem ser enriquecido para miRNAs ^{1 -2.} Muitos investigadores detectaram proteínas distintas em exossomas isoladas a partir da urina de indivíduos saudáveis, bem como aqueles com insuficiência renal e / ou doenças sistemáticas ^3-5. Os exossomas podem ser isoladas utilizando métodos diferentes, tais como de dois passos de ultracentrifugação difere....

Protocolo

NOTA:. As etapas envolvidas no isolamento dos exossomas urinário, utilizando o método de precipitação modificados são ilustrados na Figura 1 Os passos iniciais envolvem a remoção de grandes células mortas e detritos celulares por centrifugação. O sedimento final obtido a partir do sobrenadante recolhido a partir de cada etapa subsequente corresponde à exosoma, que é dissolvido em solução de isolamento por extracção adicional da proteína, ARN, e ADN.

1. Coleta de Urina

1. Antes da recolha de urina, cocktail inibidor de protease de preparar de acordo com as instruções do fabricante e adicionar 3,125 ml de este cockt....

Resultados

Exosomes urinário transportar proteínas, miRNA e mRNA biomarcadores secretadas a partir de células epiteliais renais. O isolamento e detecção destes exossomas podem fornecer uma ferramenta de diagnóstico útil para a detecção precoce de doenças renais tais como nefropatia diabética. Existem vários métodos para o isolamento de exossomas a partir de amostras de urina colhidas de indivíduos humanos. Anteriormente, em comparação seis métodos de isolamento exosome urina e investigados resultante de proteína, níveis de mRNA e .......

Discussão

A maioria dos métodos que envolvem a precipitação de exossomas a partir de urina não abordam a remoção da rede polimérica formada pela proteína Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente em grandes quantidades na urina, onde entra em armadilhas putativamente exossomas inicial durante a centrifugação a baixa velocidade. Em nosso método modificado reduzimos THP usando DTT antes da precipitação exosome. Como mostrado na Figura 2, uma quantidade mais elevada de THP foi observado na urina e não transfo.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de Centrífuga Corning 15 ml	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Inibidor de Protease Coquetel	Sigma Aldrich	P8340
Centrífuga	Sorvall
DL-ditiotreitol	Sigma Aldrich	D9779	usado na concentração final de 200 mg/ml
Sistema Novex NuPAGE SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 10 poços	Invitrogen	NP0321BOX	Para análise SDS-PAGE
ECL Advance Western blotting detection kit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	Para detecção de western blot de biomarcadores
Exoquick-TC	Reagent System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	Para isolamento de exossomos
Exossomo CD9 ELISA Kit Completo	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	Para quantificação de exossomos
Mini kit AllPrep DNA/RNA/Proteína	Qiagen	80004	Para DNA, RNA, isolamento de proteínas
Kit de limpeza Rneasy MinElute	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Espectrofotômetro	Thermo Scientific		para quantificação de proteínas
Kit de coloração de tira ProteoSilver	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	Para coloração de
géis SDS-PAGESistema de Eletroforese de Mini-Células Xcell SureLock	Life Technologies		Para executar os géis SDS-PAGE
Ensaios de microRNA TaqMan	Life Technologies		Para ensaios de RT-PCR
software qBasePlus v1.5	Biogazelle NV		Para análise de dados de ensaio RT-PCR
Anticorpo policlonal de coelho para ALIX	Millipore		Para detecção de western blot de biomarcadores
Anticorpo monoclonal de camundongo para TSG101	Abcam		Para detecção de biomarcadores de western blot