En Modifisert Nedbør Metode for å isolere Urin Exosomes
Summary
This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.
Abstract
Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.
Introduction
Urin exosomes er små interne vesikler på 100 nm av multivesikulære organer (MVB) avledet fra alle celletyper under normale og patologiske tilstander i urin plass inkludert glomerulære podocytes, nyretubuli celler og celler lining urindreneringssystemer som ser ut til å bli beriket for mirnas 1 -2. Mange forskere har oppdaget forskjellige proteiner i exosomes isolert fra urinen til friske individer så vel som de med nedsatt nyre- og / eller systematiske sykdommer 3-5. Exosomes kan isoleres ved hjelp av forskjellige metoder slik som to-trinns differensialultrasentrifugering med eller uten sukrose 6-7, ved å kombinere nanomembrane filter med ultrasentrifuge 8-9, eller utfelling 10-11. Vi har nylig utviklet en enkel, rask, skalerbar og effektiv metode for å isolere urin exosomes og oppdage miRNA og protein biomarkører 11. Selv biomarkører kan detekteres i en rekke forskjellige biologiske fluider, urine er den mest praktiske valget for pasienter med sykdommer i nyrene og urinveiene, fordi den kan oppnås i store mengder i et forholdsvis ikke-invasiv måte.
Selv om det finnes flere metoder for å isolere urin exosomes 6-11, den mest brukte fremgangsmåten er avhengig av differensialultrasentrifugering med en 30% sukrose pute. Selv om denne metoden er effektiv, og kvaliteten av de resulterende exosomes isolert med denne fremgangsmåten er høy, den teknikk som i seg selv krever faglært personell, og er tidkrevende, krever flere ultra-sentrifugeringstrinn. Andre metoder, som filtrering og nedbør, har blitt utviklet for isolering av exosomes, inkludert en som bruker en proprietær nedbør reagens (dvs. ExoQuick-TC: System biovitenskap, Mountain View, California). Selv om utfelling ved hjelp av denne reagens er rask og relativt lett, er lav renhet exosomes isolert i forhold til ultrasentrifuge method. Vi har nylig sammenlignet seks fremgangsmåter for isolering av urin exosomes, inkludert en modifikasjon av fremgangsmåten ved hjelp av utfelling ExoQuick-TC som vi utviklet i vårt laboratorium 11. Vi fant ut at dette endret nedbør metoden ga høyere mengder av protein, miRNA, og mRNA og selve inngrepet var raskere og enklere å implementere enn ultracentrifugation. Her beskriver vi den eksperimentelle protokollen av vår modifiserte nedbør metode i en stegvis, og inkluderer en drøfting av fordeler og ulemper ved denne teknikken sammenlignet med andre metoder for exosome isolasjon. Den modifiserte utfelling metoden innebærer en første utfelling av exosome partikler, etterfulgt av fjerning av Tamm-Horsfall protein, som er korrelert med exosomal proteiner og er kjent for å redusere exosome utbytte fra urin. Vi har funnet at disse modifikasjoner øker utbyttet og renheten av exosomal preparat fra urin.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fleste metoder som involverer utfelling av exosomes fra urin ikke adressen fjerning av det polymere nettverk dannet av Tamm-Horsfall protein (THP). Dette proteinet finnes i store mengder i urin, hvor det putatively feller exosomes under innledende lavhastighetssentrifugering. I vår modifiserte metode reduserte vi THP bruker DTT før exosome nedbør. Som vist i figur 2, ble en høyere mengde av THP observert i den ubehandlede urin og pellet, med ingen THP i den endelige supernatant og pellet exosome,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to the Roney Family Foundation for the support of this study. We acknowledge the contribution of Dr. M. Lucrecia Alvarez to the planning and execution of the experiments described in this work.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Corning 15ml Centrifuge Tube | Corning (Sigma Aldrich) | CLS430791 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Centrifuge | Sorvall | ||
| DL-dithiothreitol | Sigma Aldrich | D9779 | used at final concentration of 200 mg/ml |
| Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12 % Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | NP0321BOX | For SDS-PAGE analysis |
| ECL Advance Western blotting detection kit | GE Healthcare Life Sciences | RPN2135 | For western blot detection of biomarkers |
| Exoquick-TC Reagent | System Biosciences (SBI) | EXOTC50A-1 | For exosome isolation |
| Exosome CD9 ELISA Complete Kit | System Biosciences (SBI) | EXOEL-CD9-A-1 | For exosome quantification |
| AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit | Qiagen | 80004 | For DNA, RNA, Protein isolation |
| Rneasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | For Protein Quantification | |
| ProteoSilver Sliver Stain Kit | Sigma Aldrich | PROTSIL1-1KT | For staining SDS-PAGE gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Life Technologies | For running the SDS-PAGE gels | |
| TaqMan microRNA assays | Life Technologies | For RT-PCR assays | |
| qBasePlus v1.5 software | Biogazelle NV | For analysis of RT-PCR assay data | |
| Rabbit polyclonal antibody to ALIX | Millipore | For western blot detection of biomarkers | |
| Mouse monoclonal antibody to TSG101 | Abcam | For western blot detection of biomarkers |
Referências
- Miranda, K. C., Bond, D. T., McKee, M. Nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease. Kidney Int. 78, 191-199 (2010).
- Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 13368-13373 (2004).
- Raj, D. A., Fiume, I., Capasso, G., Pocsfalvi, G. A multiplex quantitative proteomics strategy for protein biomarker studies in urinary exosomes. Kidney Int. 81 (12), 1263-1273 (2012).
- Pisitkun, T., Gandolfo, M. T., Das, S., Knepper, M. A., Bagnasco, S. M. Application of systems biology principles to protein biomarker discovery: urinary exosomal proteome in renal transplantation. Proteomics Clin Appl. 6 (5-6), 268-278 (2012).
- Gonzales, P. A., Zhou, H., Pisitkun, T. Isolation and purification of exosomes in urine. Methods Mol Biol. 641, 89-99 (2010).
- Zhou, H., Yuen, P. S., Pisitkun, T. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery. Kidney Int. 69, 1471-1476 (2006).
- Thery, C., Amigorena, S., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Prot Cell Biol. 43, 3.22.1-3.22.29 (2006).
- Cheruvanky, A., Zhou, H., Pisitkun, T. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. Am J Physiol Renal Physiol. 292, 1657-1661 (2007).
- Gonzales, P. A., Pisitkun, T., Hoffert, J. D. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 20, 363-379 (2009).
- Rood, I. M., Deegens, J. K., Merchant, M. L. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney Int. 78, 810-816 (2010).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney Int. Nov. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Kang, S. W., Kim, Y. W., Kim, Y. H. Study of the association of -667 aquaporin-2 (AQP-2) A/G promoter polymorphism with the incidence and clinical course of chronic kidney disease in Korea. Renal Fail. 29, 693-698 (2007).
