Methoden für die quantitative Bestimmung von Antikörper-induzierte Komplementaktivierung auf Red Blood Cells
Summary
Hier beschreiben wir zwei Assays zur Messung von Komplement-Aktivierung durch Antikörper gegen rote Blutzellen induziert. Der große Vorteil gegenüber den aktuellen Untersuchungen ist die quantitative und einfach zu interpretieren Natur.
Abstract
Antikörper gegen rote Blutkörperchen (Erythrozyten) kann dazu führen, Aktivierung, was zu einer beschleunigten Genehmigungs über Komplement-Rezeptoren in der Leber (extravaskulären Hämolyse) oder die zu intravaskulären Lyse von Erythrozyten zu ergänzen. Alloantikörper (zB ABO) oder Autoantikörper gegen RBC-Antigene (wie in der Autoimmun-hämolytische Anämie, AIHA zu sehen), die zur Aktivierung ergänzen sind potenziell schädlich und kann – vor allem, wenn die zu intravaskulären Lyse – tödlichen ein. Derzeit Komplement-Aktivierung durch (auto)-Antikörpern auf Erythrozyten in vitro mit Hilfe der Coombs-Test reflektierende Ergänzung Abscheidung auf RBC oder durch eine nicht-quantitative Assay hämolytische reflektieren RBC Lyse 1-4 bewertet. Um jedoch die Wirksamkeit von Inhibitoren Ergänzung zu bewerten, ist es zwingend erforderlich, um quantitative Techniken haben. Hier beschreiben wir zwei solche Techniken. Zuerst wird ein Test zur C3 und C4 Abscheidung auf rote Blutzellen, die von Antikörpern in Patientenserum induziert wird erkennen vorgepräsentierte. Hierzu ist die FACS-Analyse mit Fluoreszenz-markierten anti-C3-oder Anti-C4 Antikörper verwendet. Als nächstes wird eine quantitative hämolytischen Assay beschrieben. In diesem Assay Komplement-vermittelte Hämolyse von Patientenserum induziert ist die Nutzung der spektrophotometrischen Nachweis des freigesetzten Hämoglobins gemessen. Diese beiden Tests sind sehr reproduzierbare und quantitative erleichtert Untersuchungen der Antikörper-induzierten Komplementaktivierung.
Introduction
Antikörper gegen rote Blutkörperchen (Erythrozyten) durch Transfusion von roten Blutkörperchen, die ein Antigen, das nicht auf Empfänger RBCs vorhanden ist exprimieren, induziert werden. Diese Allo-Antikörper können schwere akute hämolytische Transfusionsreaktionen aufgrund der Aktivierung auf die nach der Transfusion 5 ergänzen verursachen. In Auto-Immun-hämolytische Anämie (AIHA) haben die Patienten Auto-Antikörper gegen ihre eigenen roten Blutkörperchen. Dies führt zu einer beschleunigten Clearance der Zellen durch die Interaktion von IgG mit Fc &ggr; RBC-Rezeptoren auf Phagocyten in der Milz und / oder im Falle von Autoantikörpern in der Lage, mittels Komplement-Komplement-Rezeptoren in der Leber 6,7 aktivieren gebunden. Fulminante Komplement-Aktivierung intravaskulären Hämolyse was ist selten, aber oft tödlich. Beschleunigte ergänzen vermittelten RBC Zerstörung entweder durch Allo-oder Autoantikörpern führt zu akuter Anämie und damit potenziell tödlichen Hypoxie induziert. Die Autoantikörper in AIHA sind in warmen und kalten Antikörper eingestuft, dependinG auf der optimalen Temperatur sie Erythrozyten (37 ° C oder geringer) zu binden. Die warmen Antikörper sind in der Regel von IgG-Isotyp und die kalten Antikörper vom IgM-Isotyp 8,9. AIHA kann sekundär zB lymphoprolyferative Erkrankungen, Bindegewebserkrankungen, soliden Tumoren, Infektionen oder Medikamente sein, aber in 50% der Fälle ist idiopathischen AIHA 9.
Detektion Gammaglobuline (zB. IgG oder IgM) und Komplement gebunden Patienten RBCs mittels einer semiquantitativen direkten Antiglobulin (Coombs)-Test (DAT) durchgeführt. In dem DAT-Patienten RBCs mit Anti-IgG-oder Anti-C3d inkubiert. Das Auftreten von RBC Agglutination zeigt die Anwesenheit von Komplement-Komponenten befestigt oder IgG-Bindung. Nachweis von Allo-oder Autoantikörpern im Serum des Patienten wird mittels der indirekten Antiglobulintest (IAT) durchgeführt. In der IAT werden Bromelain behandelten Test RBCs mit Patientenserum inkubiert, gewaschen und dann mit anti-h inkubiertuman IgG. Im Falle haben RBCs mit Anti-RBC-IgG, die in dem Patientenserum Agglutination auftritt sensibilisiert. IgM-Antikörper gegen Erythrozyten wird direkt an Agglutination nach der Inkubation von Bromelain-behandelten Test Erythrozyten mit Patientenserum führen. RBC Agglutination in der direkten Coombs-Test oder im IAT wird optisch entweder mit dem Auge in einem Reagenzglas oder durch das Laden der Probe auf einer kleinen Sephadexsäule Trennung agglutinierten Erythrozyten-und Einzel nach Größe 1 bewertet.
Ein anderes häufig verwendetes Verfahren zur Komplementaktivierung auf RBCs messen, ist der hämolytischen Assay 1, bei dem die Kapazität von Patientenserum (Komplement-vermittelte) Hämolyse von Bromelain behandelten RBC 10 zu induzieren, beurteilt. Der Test wird als positiv festgestellt, wenn der Überstand nach dem Zentrifugieren wird rot wegen freigesetzte Hämoglobin gefärbt und als negativ zu sein, wenn es farblos bleibt. Sowohl das Coombs-Test und der Test sind hämolytische semiquantitative, da die höchste serum Verdünnung bezeichnet, in dem der Test ist immer noch positiv.
Der Coombs-Test und dem hämolytisch-Assay sind robust Tests, die routinemäßig in der Diagnostik eingesetzt werden. Da diese Tests sind semiquantitative und abhängig von der Erfahrung des Technikers Durchführung des Assays sie geeignet ist, subtile Unterschiede der Komplementaktivierung auf Erythrozyten zu untersuchen sind nicht, wie erforderlich, wenn die Bewertung der Wirksamkeit von Komplement-Inhibitoren. Daher entwickelten wir zwei quantitative Tests, um die Komplement-Aktivierung von (Auto-) Antikörper gegen Erythrozyten, die wir in diesem Papier beschreiben, zu bestimmen.
Zuerst wird ein Test, um die Ablagerung von Komplement-Aktivierung Fragmente C3 und C4 auf RBCs (1A) messen wir entwickelt. In diesem Test werden menschliche Bromelain behandelten Typ 0 RBCs mit hitzeinaktiviertem Patientenserum (anti-RBC Antikörper Quelle), frisch AB-Serum (Komplement-Quelle) und Anti-C5-Antikörper (Eculizumab) inkubiert. Während dieser inc.ubation wird C3 und C4 Abscheidung auftreten, wenn das Patientenserum enthält ergänzen Aktivierung anti-RBC Antikörper. Um RBC Lyse durch nachgeschaltete Komplementaktivierung verhindern eine Sperr Anti-C5-monoklonaler Antikörper wird hinzugefügt. Als nächstes wird C3 und C4 Abscheidung auf der RBCs durch FACS unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörpern oder Fab-Fragmenten Umsetzung mit C3 und C4, die jeweils detektiert. Gating auf einzelne Erythrozyten ist wichtig, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten. Vorteile dieses Verfahrens beinhalten, dass ein kleines Volumen des Patientenmaterials erforderlich ist, Komplementaktivierung in einer frühen Stufe der Kaskade bewertet wird und das Verfahren ist reproduzierbar und quantitativ. Ein weiterer Vorteil der Blick auf beide C3 und C4 ist, dass eine Unterscheidung zwischen der klassischen und Lektin-Weg-Aktivierung (sowohl C3-und C4-Deposition) und den alternativen Weg der Aktivierung (nur C3 Deposition) hergestellt werden. Die Verwendung von Bromelain behandelten Erythrozyten statt unbehandelten roten Blutkörperchen erhöht die Empfindlichkeit der alszu sagen.
Der zweite Test basiert auf der gegenwärtig verwendeten hämolytischen Assay (Fig. 1B) auf. Menschen Bromelain-behandelten Typ-0-Erythrozyten werden mit Hitze-inaktiviertem Patientenserum (anti-RBC Antikörper-Quelle) und frischem AB-Serum (Komplement-Quelle) inkubiert. Wenn Komplement von Patienten anti-RBC-Antikörper aktiviert, wird eine dosisabhängige RBC-Lyse auftreten, was zu der Hämoglobin freizusetzen. Die Menge an freigesetztem Hämoglobin wird durch Messen seiner Absorption bei 414 nm im Überstand nach Abzentrifugieren der intakten und fragmentierten Erythrozyten quantifiziert. Die Extinktion korreliert mit der Menge der Hämolyse aufgetreten. Im Gegensatz zu den derzeit verwendeten Assay erlaubt eine objektive, quantitative Wert der Hämolyse, die sehr gut reproduzierbar und unabhängig von der Person, die Interpretation des Assays ist das Protokoll.
Eine Anwendung dieser Methoden ist in 11, wobei die mögliche Verwendung von C1-Inhibitor als Komplement-Inhibitor in AIHA war s beschriebentudied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die obigen Tests sind reproduzierbar und stabil. Sie sind einfach durchzuführen und es ist möglich, sie mit vielen Proben gleichzeitig (in einer 96-well-Platte) durchzuführen. Daher würde dieser Ansatz auch für ein vollautomatisches System, z. B. eine ELISA-Robotersystem. Im Gegensatz zu den gegenwärtig verwendeten Techniken sind diese Assays quantitativ und dies wird in der Studie über die Wirkung von Komplement-Inhibitoren helfen zB. Außerdem ist die objektive Interpretation, welche eine Verb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ und DW erhalten eine zweckgebundene Zuwendung von Viropharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
Referências
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
