Summary

طرق للكشف الكمي للجسم التي يسببها تكملة التنشيط على خلايا الدم الحمراء.

Published: January 29, 2014
doi:

Summary

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات لقياس تفعيل مكملا الناجم عن أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء. وميزة كبيرة على المقايسات الحالي الكمي وطبيعة السهل تفسير ل.

Abstract

أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) يمكن أن يؤدي إلى تنشيط تكمل مما أدى إلى تسارع التخليص عبر مستقبلات مكملا في الكبد (انحلال الدم خارج الأوعية) أو يؤدي إلى تحلل كرات الدم الحمراء داخل الأوعية الدموية لل. Alloantibodies (على سبيل المثال ABO) أو الأجسام المضادة لمستضدات RBC (كما رأينا في فقر الدم الانحلالي الذاتية، AIHA) مما يؤدي إلى تفعيل تكمل يحتمل أن تكون ضارة ويمكن أن يكون – وخصوصا عندما يؤدي إلى تحلل داخل الأوعية الدموية – 1 القاتلة. حاليا، تكمل التنشيط بسبب (السيارات) الأجسام المضادة في كرات الدم الحمراء في المختبر يتم تقييم باستخدام اختبار كومبس يعكس ترسب تكمل على RBC أو عن طريق فحص الدم الانحلالي nonquantitative يعكس RBC تحلل 1-4. ومع ذلك، من أجل تقييم فعالية مثبطات مكملا، وهي ملزمة أن يكون التقنيات الكمية. نحن هنا وصف اثنين من هذه التقنيات. الأول، وهو فحص للكشف عن C3 و C4 ترسب على خلايا الدم الحمراء التي يسببها الأجسام المضادة في مصل المريض قبلsented. لهذا، يتم استخدام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية مع fluorescently المسمى مكافحة C3 أو C4 لمكافحة الأجسام المضادة. المقبل، وصفت الحالة للدم الفحص الكمي. يتم قياس انحلال الدم بوساطة تكمل في هذا الاختبار، الناجمة عن المصل المريض استفادة من الكشف الطيفي من الهيموغلوبين الافراج عنهم. كل من هذه المقايسات استنساخه جدا والكمية، وتسهيل الدراسات التنشيط تكملة الناجم عن الأجسام المضادة.

Introduction

أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) يمكن أن يتسبب عن طريق نقل الدم من كرات الدم الحمراء معربا عن مستضد والذي هو غير موجود على كرات الدم الحمراء المتلقي. ويمكن لهذه الأجسام المضادة ألو يسبب ردود فعل الانحلالي الحاد نقل نظرا لتكمل التنشيط على نقل التالية 5. في المناعة الذاتية فقر الدم الانحلالي (AIHA)، المرضى الذين لديهم أضداد ذاتية ضد كرات الدم الحمراء الخاصة بهم. وهذا يؤدي إلى تسارع إزالة الخلايا عن طريق التفاعل بين مفتش ملزمة لكرات الدم الحمراء مع Fcγ-المستقبلات على البالعات في الطحال و / أو في حالة أضداد ذاتية قادرة على تنشيط مستقبلات مكملا عبر مكملا في الكبد 6،7. تفعيل مكملا مداهم انحلال الدم داخل الأوعية الدموية مما يؤدي إلى أمر نادر الحدوث ولكن غالبا ما يكون مميتا. المعجل، تكمل بوساطة الدمار الناجم عن RBC إما النتائج أو الأجسام المضادة في ألو فقر الدم الحاد ونقص الأكسجة الأنسجة وبالتالي يحتمل أن تكون قاتلة. تصنف الأجسام المضادة لصناعة السيارات في AIHA في الأجسام المضادة الحارة والباردة، DEPENDINز على درجة الحرارة المثلى التي تربط لكرات الدم الحمراء (37 درجة مئوية أو أقل، على التوالي). الأجسام المضادة الدافئة وعادة ما تكون من مفتش نمط إسوي والأجسام المضادة الباردة من الغلوبولين المناعي نمط إسوي 8،9. AIHA يمكن أن تكون ثانوية بالنسبة لمثل lymphoprolyferative اضطرابات وأمراض النسيج الضام، والأورام الصلبة، والالتهابات أو المخدرات، ولكن في 50٪ من الحالات مجهولة السبب هو AIHA 9.

يتم إجراء كشف gammaglobulins (على سبيل المثال. مفتش أو الغلوبولين المناعي) وتكمل ملزمة لكرات الدم الحمراء المريض عن طريق اختبار ضد الغلوبولين المباشرة نصف كمي (كومبس) (DAT). في DAT يتم تحضين كرات الدم الحمراء المريض مع المضادة للمفتش أو المضادة للC3D. حدوث تراص RBC يوضح وجود مكونات تكملة المرفقة أو مفتش ملزمة. يتم إجراء الكشف عن الأجسام المضادة، ألو أو في مصل المريض عن طريق اختبار ضد الغلوبولين غير المباشرة (IAT). في معهد التكنولوجيا التطبيقية، يتم تحضين اختبار كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين مع مصل المريض، وغسلها ثم حضنت مع المضادة للحأومان مفتش. في حال تم توعية كرات الدم الحمراء مع المضادة للمفتش RBC موجودة في مصل المريض تراص سيحدث. والأجسام المضادة الغلوبولين المناعي لكرات الدم الحمراء يؤدي مباشرة إلى تراص على حضانة اختبار كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين مع مصل المريض. ويتم تقييم RBC تراص في اختبار كومبس المباشر أو في IAT بصريا إما عن طريق العين في أنبوب اختبار أو عن طريق تحميل العينة على عمود Sephadex صغيرة تفصل كرات الدم الحمراء التصق واحد عن طريق حجم 1.

آخر تقنية استخداما لقياس تفعيل تكمل على كرات الدم الحمراء هو فحص الدم الانحلالي التي يتم فيها تقييم قدرة المريض المصل للحث (بوساطة تكمل) انحلال الدم من كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين 10. ويلاحظ اختبار بأنها إيجابية عندما طاف بعد الطرد المركزي اتسخت الأحمر بسبب الهيموغلوبين صدر ويعتبر أن تكون سلبية إذا كان لا يزال عديم اللون. كل من اختبار ضد الغلوبولين وفحص الدم الانحلالي هي نصف كمي، منذ أعلى سيرووتدل م التخفيف التي الاختبار لا تزال ايجابية.

اختبار ضد الغلوبولين وفحص الدم الانحلالي والمقايسات قوية التي يتم استخدامها بشكل روتيني في التشخيص. لأن هذه القياسات ليست نصف كمي ويعتمد على تجربة أداء فني الفحص أنها ليست مناسبة لدراسة الفروق الدقيقة التنشيط تكمل على كرات الدم الحمراء، حسب الحاجة عند تقييم فعالية مثبطات مكملا. لذلك، قمنا بتطوير اثنين من المقايسات الكمية لتحديد التنشيط مكملا بنسبة (السيارات) الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء، والتي سنقوم بشرح في هذه الورقة.

الأول، وضعنا مقايسة لقياس ترسب شظايا تفعيل المتممة C3 و C4 على كرات الدم الحمراء (الشكل 1A). في هذا الاختبار، يتم تحضين المعالجة بروميلين الإنسان نوع 0 كرات الدم الحمراء مع المصل الحرارة المعطل المريض (المضادة للRBC مصدر الأجسام المضادة)، مصل AB الطازجة (المصدر مكملا) والمضادة للC5 ريتوكسيماب (Eculizumab). خلال هذا المؤتمر الوطني العراقيubation، سوف تحدث C3 و C4 ترسب إذا كان المصل يحتوي على المريض تكمل تفعيل الأجسام المضادة للRBC. من أجل منع تحلل RBC عن طريق تفعيل تكملة المصب يتم إضافة عرقلة مكافحة C5 وحيدة النسيلة الأجسام المضادة. المقبل، يتم الكشف C3 و C4 ترسب على كرات الدم الحمراء عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة fluorescently المسمى أو فاب-شظايا التفاعل مع C3 و C4، على التوالي. تبوب على كرات الدم الحمراء واحدة من المهم لضمان موثوقية النتائج. وتشمل مزايا هذه التقنية أن كمية صغيرة من مادة المريض هو مطلوب، تكمل التنشيط في مرحلة مبكرة من تتالي يتم تقييم والأسلوب هو استنساخه والكمي. ميزة إضافية للنظر في كل من C3 و C4 هو أن التمييز يمكن أن يتم بين الكلاسيكية وكتين تفعيل المسار (سواء C3 و C4 ترسب) وتفعيل مسار بديل (C3 فقط ترسب). استخدام كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين بدلا من كرات الدم الحمراء غير المعالجة يزيد من حساسية كمايقول.

ويستند الفحص الثاني على فحص الدم الانحلالي المستخدمة حاليا (الشكل 1B). يتم تحضين المعالجة بروميلين الإنسان نوع 0 كرات الدم الحمراء مع المصل الحرارة المعطل المريض (المضادة للRBC مصدر الأجسام المضادة) والمصل AB الطازجة (مصدر مكمل). إذا تم تنشيط مكملا من قبل الأجسام المضادة للRBC المريض، سوف تحدث الجرعة تعتمد RBC تحلل، مما يؤدي إلى إطلاق سراح من الهيموغلوبين. وكميا كمية الهيموجلوبين صدر عن طريق قياس الامتصاصية في 414 نانومتر في في طاف بعد الغزل أسفل كرات الدم الحمراء سليمة ومجزأة. الامتصاصية يرتبط مع كمية من انحلال الدم حدث. وعلى النقيض من الفحص المستخدمة حاليا، وهذا البروتوكول يسمح للهدف، والقيمة الكمية للانحلال الدم وهذا هو استنساخه جدا ولا تعتمد على الشخص تفسير الفحص.

وقد وصفت لتطبيق هذه الأساليب في 11، حيث كان احتمال استخدام مثبط C1-كما المانع مكملا في AIHA قtudied.

Protocol

1. إعداد بروميلين المعاملة خلايا الدم الحمراء خلايا الدم الحمراء كتبته-0 غسل 3x أخرى مع برنامج تلفزيوني 1X (الطرد المركزي في 664 x ج لمدة 2-5 دقيقة). احتضان 1 حجم كرات الدم الحمراء محملة مجلدين من حل …

Representative Results

ويبين الشكل 2A مؤامرة مبعثر ممثل لكرات الدم الحمراء. ويمكن رؤية النابضة مناسبة لكرات الدم الحمراء واحدة في دي FSC-W – FSC-A مؤامرة (P1). عادة حوالي 95٪ من كرات الدم الحمراء تقع ضمن هذه البوابة P1 (الخلايا واحد)، ولكن عندما يتم استخدام نسبة عالية من مصل المريض، وهذا يمكن …

Discussion

المقايسات أعلاه هي استنساخه وقوية. فهي سهلة لأداء وأنه من الممكن القيام بها مع العديد من العينات في نفس الوقت (في لوحة 96 أيضا). وبالتالي، فإن هذا النهج أيضا أن تكون مناسبة لنظام مؤتمتة بالكامل، مثل نظام الروبوت ELISA. وعلى النقيض من التقنيات المستخدمة حاليا، وهذه ال…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SZ وDW تتلقى منحة غير المقيد للViropharma.

Materials

PBS Fresenius Kabi
BSA Sigma B-4287
Barbital Fagron 0261 This chemical is subject to drug regulation.
Sodium Barbital Fagron 0263 This chemical is subject to drug regulation.
Gelatin Merck 1.0470.0500
Sodium chloride Merck 1.06404.1000
Magnesium Chloride Merck 1.05833.0250
Calcium chloride Merck 1.0238.0500
Dylight 488 amine reactive dye Pierce 46402
Dylight 650 amine reactive dye Pierce 62265
αC5 (Eculizumab) Alexion Pharmaceuticals
FACS (Canto) BD Any FACS can be used that has the appropiate lasers.
Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) Thermo Labsystems 1500-193 Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used
BD FACSDiva software v 6.1.2 BD 643629 Any compatible FACS analysis software can be used
bromelain Sanquin K1121

Referências

  1. Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
  2. Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
  3. Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
  4. Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
  5. Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
  6. Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
  7. Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
  8. Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
  9. Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
  10. Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
  11. Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
  12. Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
check_url/pt/51161?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Meulenbroek, E. M., Wouters, D., Zeerleder, S. Methods for Quantitative Detection of Antibody-induced Complement Activation on Red Blood Cells. J. Vis. Exp. (83), e51161, doi:10.3791/51161 (2014).

View Video