שיטות כמותיות לאיתור של הפעלת משלים-Induced נוגדן בתאי דם אדומים
Summary
כאן אנו מתארים שני מבחני למדידת הפעלת משלימים הנגרמת על ידי נוגדנים כנגד תאי דם אדומים. היתרון הגדול על פני מבחני הנוכחיים הוא מטבעם כמוני וקל לפרש.
Abstract
נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להוביל להשלמת הפעלה וכתוצאה מכך אישור מואץ באמצעות קולטנים משלימים בכבד (המוליזה extravascular) או מוביל לתמוגה intravascular של RBCs. Alloantibodies (למשל ABO) או נוגדנים עצמיים לאנטיגנים RBC (כפי שניתן לראות באנמיה המוליטית אוטואימונית, AIHA) המוביל כדי להשלים את ההפעלה הם מזיקים ויכול להיות – במיוחד כאשר מובילים לתמוגה intravascular – 1 קטלני. נכון לעכשיו, להשלים את ההפעלה בשל (אוטומטי)-נוגדנים על פני כדוריות דם אדום נבחנת במבחנה על ידי שימוש בבדיקת קומבס משקפת בתצהיר משלים בRBC או על ידי assay המוליטית nonquantitative משקף RBC תמוגה 1-4. עם זאת, כדי להעריך את היעילות של מעכבי משלים, הוא חובה שיש טכניקות כמותיות. כאן אנו מתארים שתי טכניקות כאלה. ראשית, assay כדי לזהות C3 ו-C4 בתצהיר על תאי דם אדומים הנגרמים על ידי נוגדנים בסרום חולה מראשsented. לשם כך, ניתוח FACS משמש עם נוגדנים נגד C3 או אנטי-C4 שכותרתו fluorescently. בשלב הבא, assay המוליטית כמותית מתואר. המוליזה ב assay זה, להשלים בתיווך הנגרמת על ידי סרום מטופל נמדדת שימוש ביצוע של זיהוי spectrophotometric של המוגלובין שפורסם. שני מבחני האלה הם מאוד לשחזור וכמותיים, בהנחיית מחקרים של הפעלת משלים-Induced נוגדן.
Introduction
נוגדנים כנגד תאי דם אדומים (RBCs) יכולים להיגרם על ידי עירוי של תאי דם אדומים מבטאים אנטיגן שאינו נמצא בתאי דם אדומים נמען. הלו, נוגדנים אלו יכולים לגרום לתגובות קשות חריפות המוליטית עירוי עקב להשלים הפעלה על העירוי 5 הבא. באנמיה המוליטית אוטואימונית (AIHA), חולים נוגדנים עצמיים כנגד תאי הדם האדום שלהם. זה מוביל לאישור מואץ של התאים באמצעות האינטראקציה של IgG חייבת RBCs עם Fcγ-קולטנים על phagocytes בטחול ו / או במקרה של נוגדנים עצמיים מסוגלים להפעיל משלימים באמצעות קולטנים משלימים בכבד 6,7. הפעלת השלמה המוחלטת של תפקוד וכתוצאה מכך המוליזה intravascular היא נדירה אך לעתים קרובות קטלנית. מואץ, משלים הרס RBC בתיווך הנגרם על ידי או תוצאותיו הלו או נוגדנים עצמיים באנמיה חריפה וחוסר חמצן ברקמות ומכאן שעלול להיות קטלני. הנוגדנים העצמיים בAIHA מסווגים בנוגדנים חמים וקרים, תלויg על הטמפרטורה האופטימלית הם נקשרים לתאי דם אדומים (37 מעלות צלזיוס או נמוכה, בהתאמה). הנוגדנים הם בדרך כלל החמים של אלוטיפ IgG והנוגדנים הקרים של IgM אלוטיפ 8,9. AIHA יכולה להיות משנית לדוגמא lymphoprolyferative הפרעות, מחלות רקמת חיבור, גידולים מוצקים, זיהומים או סמים, אבל ב50% מהמקרים AIHA היא אידיופטית 9.
איתור של gammaglobulins (למשל. IgG או IgM) ומשלים כבול לRBCs של המטופל מתבצע באמצעות antiglobulin הישיר semiquantitative מבחן (קומבס) (DAT). בDAT RBCs מטופל מודגרת עם אנטי IgG או אנטי C3d. מופע של התלכדות RBC מדגים את נוכחותם של רכיבים משלימים מצורפים או IgG מחייב. זיהוי שלו הלו או נוגדנים עצמיים בסרום של המטופל מתבצע באמצעות הבדיקה העקיפה antiglobulin (IAT). בIAT, RBCs המבחן טופלו ברומלין מודגרת עם סרום מטופל, נשטף ולאחר מכן הודגרו עם אנטי-hאומן IgG. במקרה RBCs כבר רגיש עם הווה נגד RBC IgG בהתלכדות סרום המטופל יתרחש. נוגדני IgM לRBCs ישירות יובילו להתלכדות על דגירה של RBCs מבחן טופלו ברומלין עם סרום מטופל. התלכדות RBC בבדיקת קומבס הישירה או בIAT מוערך מבחינה ויזואלית או על ידי העין במבחנה או על ידי טעינת המדגם על עמודת Sephadex קטנה מפרידה RBCs agglutinated ואחת לפי גודל 1.
טכניקה משמשת לעתים קרובות אחרת למדוד הפעלה משלים על פני כדוריות דם אדום היא assay המוליטית 1, שבו היכולת של סרום מטופל כדי לגרום להמוליזה (משלים בתיווך) של תאי דם אדומים שטופלה ברומלין 10 מוערכת. המבחן הוא כאמור חיובי כאשר את supernatant לאחר צנטריפוגה מוכתם אדום בשל המוגלובין שוחרר ונחשב לשלילי אם הוא נשאר חסר צבע. שתי מבחן antiglobulin וassay המוליטית הם semiquantitative, מאז Seru הגבוה ביותרהדילול מ 'הוא כונה שבמבחן הוא עדיין חיובי.
מבחן antiglobulin וassay המוליטית הם מבחני חזקים המשמשים באופן שיגרתי באבחון. מאז מבחני אלה הם semiquantitative ותלויים בניסיונו של טכנאי ביצוע assay הם אינם מתאימים ללמוד להבדלים של הפעלת משלים על פני כדוריות דם אדומים, במידת צורך בעת הערכת היעילות של מעכבי משלים. לכן, פיתחנו שני מבחני כמותיים כדי לקבוע הפעלת ההשלמה על ידי נוגדנים (אוטומטי) לתאי דם אדומים, שנתאר במאמר זה.
ראשית, פיתחנו assay כדי למדוד את התצהיר של שברי הפעלה של משלים C3 ו-C4 על פני כדוריות דם אדומים (איור 1 א). ב assay זה, מסוג 0 RBCs טופלו ברומלין אדם מודגרת עם סרום חום מומת מטופל (מקור נוגדן אנטי RBC), סרום טרי AB (מקור משלים) ונוגדנים חד שבטיים אנטי C5 (Eculizumab). במהלך inc זהubation, בתצהיר C3 ו-C4 יתרחש אם הסרום מכיל המטופל להשלים הפעלת נוגדנים נגד RBC. על מנת למנוע תמוגה RBC על ידי הפעלת משלים במורד הזרם נוגדן חד שבטי אנטי C5 חסימה הוא הוסיף. בשלב בא, בתצהיר C3 ו-C4 על פני כדוריות הדם האדום הוא זוהה על ידי FACS באמצעות נוגדנים חד שבטיים או שכותרתו fluorescently Fab-ברים מגיבים עם C3 ו-C4, בהתאמה. Gating על פני כדוריות דם אדום בודדות הוא חשוב כדי להבטיח את אמינות התוצאות. יתרונות של שיטה זו כוללים שנפח קטן של חומר מטופל נדרש, תשלים את ההפעלה בשלב מוקדם של המפל מוערך והשיטה לשחזור וכמותיים. יתרון נוסף של התבוננות בשני C3 ו-C4 הוא שניתן להבחין בין ההפעלה הקלסית וקטיני המסלול (גם C3 ו-C4 בתצהיר) וההפעלה החלופית מסלול (רק בתצהיר C3). השימוש בתאי הדם אדום שטופלה ברומלין במקום RBCs מטופל מגביר את הרגישות של כאומר.
Assay השני מתבסס על assay משמש כיום המוליטית (איור 1). סוג-0 RBCs טופלו ברומלין אדם מודגרת עם סרום חום מומת מטופל (מקור נוגדן אנטי RBC) וסרום טרי AB (מקור משלים). אם משלימים מופעל על ידי נוגדנים נגד RBC מטופל, תמוגה RBC תלויה המינון תתרחש, מה שמוביל לשחרור של המוגלובין. כמות ההמוגלובין שפורסם היא לכימות על ידי מדידת הספיגה שלה ב414 ננומטר בsupernatant לאחר שצנח RBCs השלמה ומקוטע. הספיגה בקורלציה עם הכמות של המוליזה התרחשה. בניגוד לassay משמש כיום, פרוטוקול זה מאפשר לאובייקטיבי, ערכם הכמותי של המוליזה כי הוא מאוד לשחזור ואינו תלוי באדם לפרש את assay.
יישום של שיטות אלה תואר ב11, שבם השימוש הפוטנציאלי של C1-מעכב כמעכב משלים בAIHA היה שלtudied.
Protocol
Representative Results
Discussion
מבחני לעיל הם שחזור וחזקים. הם קלים לביצוע וניתן לבצע אותם עם דגימות רבות באותו הזמן (בצלחת 96 היטב). לפיכך, גישה זו תהיה גם מתאימה למערכת אוטומטית לחלוטין, כגון: מערכת רובוט ELISA. בניגוד לטכניקות המשמשות כיום, מבחני האלה הם כמוני וזה יעזור לדוגמא: במחקר של ההשפע?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ וDW לקבל מענק בלתי מוגבל של ViroPharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
Referências
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
