Metoder for kvantitativ påvisning av antistoff-indusert komplementaktivering på røde blodlegemer
Summary
Her beskriver vi to analyser for måling av komplementaktivering indusert av antistoff mot røde blodlegemer. Den store fordelen over dagens analyser er deres kvantitative og lett-å-tolke naturen.
Abstract
Antistoffer mot røde blodceller (RBC) kan føre til komplementaktivering som fører til en akselerert klaring via komplementreseptorer i leveren (ekstravaskulær hemolyse), eller fører til intravaskulær lyse av røde blodlegemer. Alloantibodies (f.eks ABO) eller autoantistoffer mot RBC antigener (som sett i autoimmun hemolytisk anemi, AIHA) som fører til komplementaktivering er potensielt skadelig og kan være – spesielt når som fører til intravaskulære lysis – fatal en. For tiden er komplementaktivering på grunn av (auto)-antistoffer på RBC-er undersøkt in vitro ved hjelp av Coombs test reflekterende komplementavsetning på RBC eller av et nonquantitative hemolytisk assay reflekterende RBC 1-4. Men for å vurdere effekten av komplement-hemmere, er det obligatorisk å ha kvantitative teknikker. Her beskriver vi to slike teknikker. For det første er pre et assay for å påvise C3-og C4-avleiring på røde blodceller som er indusert av antistoffer i pasientserumsentert. For dette er FACS-analyse brukes med fluorescensmerkede anti-C3-eller anti-C4-antistoffer. Deretter ble et kvantitativt hemolytisk analysen beskrevet. I dette assay, komplement-mediert hemolyse indusert av pasientserum blir målt gjør bruk av spektrofotometrisk detektering av det frigjorte hemoglobin. Begge disse analysene er meget reproduserbare og kvantitativ, tilrettelegging for studier av antistoff-fremkalt komplement-aktivering.
Introduction
Antistoffer mot røde blodceller (RBC) kan induseres ved transfusjon av røde blodlegemer uttrykker et antigen som ikke er tilstede på mottaker RBC. Disse allo-antistoffer kan føre til alvorlige akutte hemolytiske transfusjonsreaksjoner på grunn av komplementaktivering på følgende transfusjon fem. I auto-immune hemolytisk anemi (AIHA), pasienter har auto-antistoffer mot sine egne RBC. Dette fører til raskere clearance av cellene via interaksjonen av IgG bundet til røde blodlegemer med Fcγ-reseptorer på fagocytter i milten og / eller i tilfelle av auto-antistoffer i stand til å aktivere komplement via komplementreseptorer i leveren 6,7. Fulminant komplementaktivering resulterer i intravaskulær hemolyse er sjeldne, men ofte dødelig. Akselerert, utfylle mediert RBC ødeleggelse indusert av enten allo-eller autoantistoffer resulterer i akutt anemi og dermed potensielt dødelig vev hypoksi. De auto-antistoffer i AIHA er klassifisert i varme og kalde antistoffer, depending på den optimale temperatur de binder seg til RBC-er (37 ° C eller lavere, henholdsvis). De varme antistoffer er vanligvis av IgG-isotype, og de kalde antistoffer av IgM-isotypen 8,9. AIHA kan være sekundært til f.eks lymphoprolyferative lidelser, bindevevssykdommer, solide svulster, infeksjoner eller medikamenter, men i 50% av tilfellene AIHA er idiopatisk ni.
Påvisning av gammaglobulins (f.eks. IgG eller IgM) og utfylle bundet til pasientens RBC er utført ved hjelp av en semikvantitativ direkte antiglobulin (Coombs) test (DAT). I DAT pasientens RBC-er ble inkubert med anti-IgG eller anti-C3d. Forekomst av RBC agglutinasjon demonstrerer tilstedeværelse av vedlagte komplementkomponenter eller IgG-binding. Påvisning av allo-eller antistoffer i pasientens serum utføres ved hjelp av den indirekte antiglobulintest (IAT). I IAT, er bromelain behandlede test RBC-er inkubert med pasientserum, ble vasket og deretter inkubert med anti-hUman IgG. I tilfelle RBCs er blitt sensibilisert med anti-RBC IgG til stede i pasientens serum agglutinasjon oppstår. IgM antistoffer mot RBC vil direkte føre til agglutinasjon ved inkubasjon av bromelain behandlet test RBC med pasientserum. RBC agglutinasjon i den direkte Coombs test eller i IAT blir vurdert visuelt, enten ved øyet i et testrør, eller ved å laste prøven på en liten Sephadex kolonne separere agglutinerte og enkelt RBCs ved størrelse 1.
Et annet ofte brukt teknikk for å måle komplementaktivering på RBC-er den hemolytiske analysen 1, karakterisert ved at kapasiteten av pasientserum til å indusere (komplement-mediert) hemolyse av bromelain-behandlede røde blodlegemer 10 blir vurdert. Testen er kjent som positiv når supernatanten etter sentrifugering er farget rødt på grunn av frigjort hemoglobin og anses å være negativ hvis det forblir fargeløse. Både antiglobulintest og den hemolytiske analysen er semikvantitativ, ettersom den høyeste serum fortynning betegnes som testen fortsatt er positive.
Den antiglobulintest og hemolytisk analysen er robuste analyser som brukes rutinemessig i diagnostikk. Siden disse analysene er semikvantitativ og avhengig av erfaringen til teknikeren utførelse av analysen er de ikke egnet for å studere små forskjeller i komplementaktivering for RBC-er, som er nødvendig når man skal vurdere effekten av komplement-inhibitorer. Derfor utviklet vi to kvantitative analyser for å fastslå komplementaktivering av (auto-) antistoffer til RBC, som vi vil beskrive i denne artikkelen.
Først, har vi utviklet en analyse for å måle avsetningen av aktiverings fragmenter av komplement C3 og C4 på RBC-er (fig. 1A). I denne analyse, er humane bromelain behandlet type 0 RBCs inkubert med varme-inaktivert pasientserum (anti-RBC-antistoff-kilde), friskt AB serum (komplementkilde), og anti-C5 monoklonalt antistoff (Eculizumab). I løpet av denne incubation, vil C3 og C4 deponering oppstår hvis pasienten serum inneholder kompaktiverende anti-RBC-antistoffer. For å hindre at RBC ved nedstrøms komplementaktivering en blokkerende anti-C5 monoklonalt antistoff blir tilsatt. Deretter er C3-og C4 avsetning på RBCs detektert ved FACS ved bruk av fluorescensmerkede monoklonale antistoffer eller Fab-fragmenter som reagerer med C3 og C4, respektivt. Gating on enkelt RBC-er viktig for å sikre påliteligheten av resultatene. Fordelene ved denne teknikk er at et lite volum av pasientmaterialet er nødvendig, komplementaktivering på et tidlig trinn av kaskaden blir vurdert, og fremgangsmåten er reproduserbar og kvantitativ. En ytterligere fordel av å se på begge C3 og C4 er at en distinksjon kan gjøres mellom den klassiske og lectin aktiveringsveien (både C3-og C4-avsetning) og den alternative aktiveringsveien (bare C3 deposition). Anvendelse av bromelain-behandlede røde blodlegemer i stedet for ubehandlede RBCs øker følsomheten til somsi.
Den andre analysen er basert på for tiden brukes hemolytiske analysen (figur 1B). Menneskelige bromelain behandlet type 0 RBC blir inkubert med varme-inaktivert pasientserum (anti-RBC-antistoff-kilde) og frisk AB serum (komplementkilde). Hvis komplement aktiveres av pasienten anti-RBC-antistoffer, vil doseavhengig RBC forekomme, som fører til frigjøring av hemoglobin. Mengden av frigjort hemoglobin er kvantifisert ved å måle absorbans ved 414 nm i supernatanten etter sentrifugering ned intakt og fragmentert RBC-er. Absorbansen korrelerer med mengden av oppstått hemolyse. I motsetning til den nåværende brukte analysen, gir denne protokollen for en objektiv, kvantitativ verdi for hemolyse som er meget reproduserbar og ikke avhengig av personen tolke analysen.
En anvendelse av disse fremgangsmåter er blitt beskrevet i 11, hvor den potensielle bruk av C1-inhibitor som komplement inhibitor i AIHA var studied.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ovennevnte analyser er reproduserbar og robust. De er lette å utføre, og det er mulig å utføre dem med mange prøver samtidig (i en 96-brønns plate). Derfor ville denne metode også være egnet for et helautomatisk system, for eksempel en ELISA robotsystem. I motsetning til de i dag brukte teknikk er disse analysene er kvantitativt, og dette vil bidra til å for eksempel i studier av effekten av komplement-inhibitorer. Videre er tolkningen målet, noe som er en forbedring i forhold til de nåv?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SZ og DW får en ubegrenset tilskudd av ViroPharma.
Materials
| PBS | Fresenius Kabi | ||
| BSA | Sigma | B-4287 | |
| Barbital | Fagron | 0261 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Sodium Barbital | Fagron | 0263 | This chemical is subject to drug regulation. |
| Gelatin | Merck | 1.0470.0500 | |
| Sodium chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
| Magnesium Chloride | Merck | 1.05833.0250 | |
| Calcium chloride | Merck | 1.0238.0500 | |
| Dylight 488 amine reactive dye | Pierce | 46402 | |
| Dylight 650 amine reactive dye | Pierce | 62265 | |
| αC5 (Eculizumab) | Alexion Pharmaceuticals | ||
| FACS (Canto) | BD | Any FACS can be used that has the appropiate lasers. | |
| Spectrophotometer (e.g. Multiskan spectrum) | Thermo Labsystems | 1500-193 | Any spectrophotometer with the right wavelength range can be used |
| BD FACSDiva software v 6.1.2 | BD | 643629 | Any compatible FACS analysis software can be used |
| bromelain | Sanquin | K1121 |
Referências
- Zeerleder, S. Autoimmune haemolytic anaemia – a practical guide to cope with a diagnostic and therapeutic challenge. Neth. J. Med. 69 (4), 177-184 (2011).
- Reardon, J. E., Marques, M. B. Laboratory evaluation and transfusion support of patients with autoimmune hemolytic anemia. Am. J. Clin. Pathol. 125, 71-77 (2006).
- Lai, M., Leone, G., Landolfi, R. Autoimmune hemolytic anemia with gel-based immunohematology tests. Am. J. Clin. Pathol. 139 (4), 457-463 (2013).
- Zantek, N. D., Koepsell, S. A., Tharp Jr, ., R, D., Cohn, C. S. The direct antiglobulin test: A critical step in the evaluation of hemolysis. Am. J. Hematol. 87 (7), 707-709 (2012).
- Natukunda, B., Brand, A., Schonewille, H. Red blood cell alloimmunization from an African perspective. Curr. Opin. Hematol. 17 (6), 565-570 (2010).
- Packman, C. H. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev. 22 (1), 17-31 (2008).
- Berentsen, S., Tjønnfjord, G. E. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 26 (3), 107-115 (2012).
- Petz, L. D. Cold antibody autoimmune hemolytic anemia. Blood Rev. 22 (1), 1-15 (2008).
- Barros, M. M. O., Blajchman, M. A., Bordin, J. O. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 195-210 (2010).
- Endoh, T., et al. Optimal prewarming conditions for Rh antibody testing. Transfusion. 46 (9), 1521-1525 (2006).
- Wouters, D., et al. C1-esterase inhibitor concentrate rescues erythrocytes from complement-mediated destruction in autoimmune hemolytic anemia. Blood. 121 (7), 1242-1244 (2013).
- Arndt, P. A., Garratty, G. A Critical Review of Published Methods for Analysis of Red Cell Antigen-Antibody Reactions by Flow Cytometry, and Approaches for Resolving Problems with Red Cell Agglutination. Transfus. Med. Rev. 24 (3), 172-194 (2010).
