Polysome 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석
Summary
여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.
Abstract
mRNA의 번역의 정확한 제어는 특히 생리 학적 및 병리학 적 스트레스에 대한 응답으로, 진핵 세포의 항상성을 위해 필수적입니다. 이 프로그램의 변경은 암 발달의 특징, 또는 신경 퇴행성 질환에서와 같이 조기 세포의 죽음에 손상된 세포의 성장으로 이어질 수 있습니다. 병진 제어를위한 분자 기초 관련된 알려진 정보의 대부분은 밀도 구배 분별 시스템을 사용 polysome 분석으로부터 수득되었다. 이 기술은 선형 자당 기울기에 세포질 추출물을 원심 분리에 의존합니다. 스핀이 완료되면, 시스템은 다른 번역에 대응하는 원심 분리 영역 분별하고 정량화 따라서 polysome 프로파일의 결과 인구 리보솜 허용한다. polysome 프로파일의 변화는 스트레스의 여러 유형에 대한 응답으로 발생 번역 개시의 변화 또는 결함을 나타내는 수 있습니다. 이 기술은 또한 일을 평가 할 수 있습니다전자 번역 개시에 특정 단백질의 역할, 특정의 mRNA의 번역 활동을 측정 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 정상 또는 스트레스도 성장 조건에서 진핵 세포와 조직의 번역 개시를 평가하기 위해 polysome 프로파일을 수행하기 위해 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
진핵 세포는 지속적으로 빠른 적응 세포 반응을 필요 유해한 생리 학적 및 환경 스트레스 조건의 범위를 발생. 세포 스트레스 반응은 안티 – 생존과 프로 생존 행동 요인 사이의 정확한 균형을 포함한다. 이 균형을 방해하는 것은 암과 신경 퇴행성 질환 등 인간의 병리의 개발을 선도하는 돌이킬 수없는 결과를 초래할 수 있습니다. 스트레스 반응의 제 1 단계를 실시하는 동안, 세포는 mRNA의 번역 수준에서의 유전자 발현의 변화의 조정 제어를 포함하는 계의 생존 경로를 활성화.
진핵 생물의 mRNA의 번역은 번역 개시 인자 (EIFS), 특정 RNA 결합 단백질 (RBDS), 그리고 RNA 분자에서 1 사이의 조정의 상호 작용을 포함하는 복잡한 세포 과정이다. 개시, 신장, 및 종료 : mRNA의 번역은 세 가지 단계로 구분된다. 모두 3 단계 REGU 대상이지만병진 제어 메커니즘 따라서이 단백질 합성의 속도 – 제한 단계를 구성하는 대부분의 번역 개시 위상을 표적 곡선 띠의 외곽에 있음을 주목 메커니즘.
번역 개시 내가 사전 개시 복합체의 형성에 선도적 인, 삼원 복잡하고 40S 리보솜 서브 유닛에 그 이후의 바인딩을 만난 eIF2a.GTP.Met-tRNA의 형성으로 시작하는 높은 주문 프로세스입니다. 다음 단계는 그러한 eIF4F eIF3와 같은 번역 개시 인자의 활성을 수반의 mRNA에 preinitiation 착체의 채용이다. 이렇게 형성된 48S preinitiation 단지는 AUG 개시 코돈을 인식 할 때까지의 mRNA의 5'-비 번역 영역을 스캔을 시작하기 위해이 기계를 가능하게 특정 구조적 변화를 겪는다. 번역 개시 인자의 대부분이어서 해제되고 60S 소단위가 80S을 형성하도록 채용되어 리보솜 복합체 번역, 관할t 어떤 점 단백질 합성의 시작 (그림 1). 상세 한 80S보다 monosome는 소위 polysomes (또는 폴리 리보솜)의 제조시에 동일의 mRNA를 번역 할 수있다. 의 mRNA에 polysomes의 밀도는 개시, 신장 및 종료 속도를 반영하고, 따라서 특정 성적 증명서의 번역 가능성의 척도이다. 그러나 polysome 프로필은 주로 개시 단계에서 mRNA의 번역의 변화를 평가하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 번역 개시 억제제와 같은 프로 테아 좀 억제제를 사용했습니다. 이 약물을 가진 암 세포의 치료는 번역 개시 인자 eIF2a 3 인산화 HRI라는 스트레스 키나아제의 활성화에 의해 특징 스트레스 반응을 유도한다. eIF2a의 인산화는 포유 동물 세포 4의 번역 개시의 억제로 이어지는 주요 행사 중 하나입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수 크로스 구배에서 polysome 프로파일 분석은 세포 나 조직으로부터 분리 9,11-14 polysomes의 농도를 분석하여 번역 개시의 측정을 허용한다. 이 기술은 최고 접근 (없는 독특한 경우) 생체 내에서 번역 개시를 측정합니다. 이것은 세포주기 (15) 동안 세포를 성장의 병진 상태를 모니터링하고, 번역 개시에, 바이러스 감염, 저산소증 13,16, 방사선 (17), 화학 약물 요?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PA는 라발 대학의 의학부에서 장학금 "피에르 듀 런드"의 수상자이다. 이 작품은 polysome의 분별이 RMR M 새로운 CIHR 조사 급여 상을 보유하고 혁신 보조금에 대한 캐나다 재단 (MOP – GF091050)를 통해 획득 한 RM은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (MOP – CG095386)에 의해 지원되었다.
우리는 박사 부부에게 감사의 말씀을 전합니다. 도움이 조언 E. Khandjian, I. Gallouzi, S. 디 마르코와 A. Cammas.
Materials
| Cells | ||||
| HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
| Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
| Culture medium and Supplements | ||||
| Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
| DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
| FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
| penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
| Sucrose solutions | ||||
| D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
| Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
| Lysis buffer | ||||
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
| NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
| DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
| Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
| SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
| RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
| Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
| RNA Extraction | ||||
| Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
| Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
| Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
| Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
| Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
| Antibodies | ||||
| anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
| anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
| Others | ||||
| Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
| DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
| RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
| Materials | ||||
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
| 1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
| Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
| Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
| Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
| Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
| Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
| Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
| Optical Microscope | Olympus CK2 | |||
Referências
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