Мы описываем протокол ПЦР в реальном времени к профилю микроРНК в спинномозговой жидкости (ликвора). За исключением протоколов экстракции РНК, процедура может быть расширена до РНК, выделенной из других жидкостей организма, культивируемых клеток или тканей образцов.
Микро РНК (микроРНК) составляют мощный слой регуляции генов, направляя RISC таргетинг на сайты, расположенные на мРНК и, следовательно, путем модуляции их репрессии трансляции. Изменения в экспрессии микроРНК, как было показано, участвуют в развитии всех основных сложных заболеваний. Кроме того, недавние исследования показали, что микроРНК может быть секретируется во внеклеточную среду и попадают в кровоток и другие жидкости организма, где они могут циркулировать с высокой стабильностью. Функция такого циркулирующего микроРНК остается в значительной степени неуловимым, но систематические подходы высокой пропускной способностью, такие как микроРНК профилирования массивов, привели к идентификации подписей микроРНК в нескольких патологических состояний, в том числе нейродегенеративных расстройств и несколько видов рака. В этом контексте, выявление микроРНК профиля экспрессии в спинномозговой жидкости, о чем сообщается в недавнем исследовании, делает микроРНК привлекательными кандидатами для анализа биомаркеров.
_content "> Есть несколько инструментов, доступных для профилирования микроРНК, такие как микрочипы, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР), и глубокое секвенирование. Здесь мы описываем чувствительный метод для профилирования микроРНК в спинно-мозговой жидкости с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Мы использовали Exiqon микроРНК готовые к использованию ПЦР человека панелей я и II V2.R, что позволяет обнаружение 742 уникальных человеческих микроРНК. Мы провели массивы в трех экземплярах трасс и мы обработаны и проанализированы данные с помощью программного обеспечения Genex Профессиональный 5.Используя этот протокол, мы успешно профилированного микроРНК в различных типах клеточных линий и первичных элементов, CSF, плазмы и фиксированных формалином парафин тканях.
Микро РНК относятся к семейству малых (21-23 нт в длину) некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционно. микроРНК может быть секретируется в межклеточное пространство, где они появляются, чтобы быть относительно стабильным. При определении изменения в экспрессии микроРНК может быть важным шагом на пути выявления биомаркеров, выполняя профили микроРНК и обработке большого количества данных может быть пугающим.
Здесь мы опишем протокол для определения изменения в экспрессии микроРНК в спинномозговой жидкости (применимой к другими биологическими жидкостями) чувствительным ПЦР в реальном времени. Мы также описывают использование программного обеспечения для анализа данных, в том числе статистического анализа и графического представления результатов. Вся процедура относительно легко и просто и, в зависимости от количества образцов, профилированных и количество машин ПЦР в реальном времени, доступных, также относительно быстро. Экспериментальная часть требует точности в обработкеРНК и пипетки в 384-луночных планшетах, в то время как раздел анализа данных с использованием Genex требуется некоторые базовые знания в области информатики и статистики.
Микро РНК являются малые РНК некодирующих, которые регулируют экспрессию генов путем ингибирования перевод и / или содействие деградации мРНК 2. Благодаря своей высокой стабильности в условиях бесклеточных, микроРНК были обнаружены во многих жидкостях организма. Кроме того, отл?…
The authors have nothing to disclose.
Проект описывается поддержали Award Количество R01MH079751 (PI: Ф. Перуцци) из Национального института психического здоровья. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института психического здоровья или Национального института здоровья.
Table III. List of equipment
Equipment |
Company |
Catalog Number |
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter |
Thermo Scientific |
HH05279 |
Finntip Pipette Tips |
Thermo Scientific |
9400613 |
Thermal Cycler C1000 |
Biorad |
|
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes |
Biorad |
TLS0801 |
Flat Cap Strips |
Biorad |
TLS0803 |
LightCycler® 480 Real-Time PCR System |
Roche |
|
LightCycler® 480 Sealing Foil |
Roche |
04 729 757 001 |
Refrigerated Centrifuge 5804R |
Eppendorf |
|
Swing-bucket Rotor, 4-place |
Eppendorf |
A-4-44 |
Bench-Top Mini Centrifuge |
Fisher |
05-090-100 |
Bench-Top Vortex |
Fisher |
|
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized |
Fisher |
02-681-5 |
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml |
Thermo Scientific |
8093 |
Thermomixer Confort |
Eppendorf |
|
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15 |
Sigma |
|
Bench-Top Vortex |
Velp Scientifica |
F202A0173 |
Table IV. List of reagents
Reagents |
Company |
Catalog Number |
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns |
Exiqon |
203300 |
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml |
Exiqon |
203400 |
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free |
Invitrogen |
10977-015 |
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R |
Exiqon |
203608 |
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations |
Ambion |
AM1556 |
MS2 RNA carrier |
Roche Applied Science |
10165948001 |
2Betamercaptoethanol 98% |
Sigma Aldrich |
M3148-25ml |
Ethanol 100% |
Carlo Erba |
64-17-5 |
Nuclease free water |
Qiagen |
1039480 |
RNAse Zap® |
Ambion |
AM9780 |