Спинномозговой жидкости профилирования микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени

Summary

Мы описываем протокол ПЦР в реальном времени к профилю микроРНК в спинномозговой жидкости (ликвора). За исключением протоколов экстракции РНК, процедура может быть расширена до РНК, выделенной из других жидкостей организма, культивируемых клеток или тканей образцов.

Abstract

Микро РНК (микроРНК) составляют мощный слой регуляции генов, направляя RISC таргетинг на сайты, расположенные на мРНК и, следовательно, путем модуляции их репрессии трансляции. Изменения в экспрессии микроРНК, как было показано, участвуют в развитии всех основных сложных заболеваний. Кроме того, недавние исследования показали, что микроРНК может быть секретируется во внеклеточную среду и попадают в кровоток и другие жидкости организма, где они могут циркулировать с высокой стабильностью. Функция такого циркулирующего микроРНК остается в значительной степени неуловимым, но систематические подходы высокой пропускной способностью, такие как микроРНК профилирования массивов, привели к идентификации подписей микроРНК в нескольких патологических состояний, в том числе нейродегенеративных расстройств и несколько видов рака. В этом контексте, выявление микроРНК профиля экспрессии в спинномозговой жидкости, о чем сообщается в недавнем исследовании, делает микроРНК привлекательными кандидатами для анализа биомаркеров.

_content "> Есть несколько инструментов, доступных для профилирования микроРНК, такие как микрочипы, количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР), и глубокое секвенирование. Здесь мы описываем чувствительный метод для профилирования микроРНК в спинно-мозговой жидкости с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Мы использовали Exiqon микроРНК готовые к использованию ПЦР человека панелей я и II V2.R, что позволяет обнаружение 742 уникальных человеческих микроРНК. Мы провели массивы в трех экземплярах трасс и мы обработаны и проанализированы данные с помощью программного обеспечения Genex Профессиональный 5.

Используя этот протокол, мы успешно профилированного микроРНК в различных типах клеточных линий и первичных элементов, CSF, плазмы и фиксированных формалином парафин тканях.

Introduction

Микро РНК относятся к семейству малых (21-23 нт в длину) некодирующих РНК, которые регулируют экспрессию генов посттранскрипционно. микроРНК может быть секретируется в межклеточное пространство, где они появляются, чтобы быть относительно стабильным. При определении изменения в экспрессии микроРНК может быть важным шагом на пути выявления биомаркеров, выполняя профили микроРНК и обработке большого количества данных может быть пугающим.

Здесь мы опишем протокол для определения изменения в экспрессии микроРНК в спинномозговой жидкости (применимой к другими биологическими жидкостями) чувствительным ПЦР в реальном времени. Мы также описывают использование программного обеспечения для анализа данных, в том числе статистического анализа и графического представления результатов. Вся процедура относительно легко и просто и, в зависимости от количества образцов, профилированных и количество машин ПЦР в реальном времени, доступных, также относительно быстро. Экспериментальная часть требует точности в обработкеРНК и пипетки в 384-луночных планшетах, в то время как раздел анализа данных с использованием Genex требуется некоторые базовые знания в области информатики и статистики.

Protocol

Следующий протокол описывает стандартную процедуру, чтобы изолировать РНК из CSF и профильных микроРНК с использованием готовых ПЦР планшет. Следует отметить, что извлечение органическую фазу не является обязательным, и что РНК носитель добавляют к образцу во время экстракции, обеспеч…

Representative Results

Результаты этого исследования были опубликованы ранее 1. Рисунок 1 показывает результаты анализа кандидатов справочных микроРНК с использованием приложения geNorm. Соответственно, два микроРНК, микроРНК-622 и микроРНК-1266, были определены в качестве эталонных генов и были ис…

Discussion

Микро РНК являются малые РНК некодирующих, которые регулируют экспрессию генов путем ингибирования перевод и / или содействие деградации мРНК ^2. Благодаря своей высокой стабильности в условиях бесклеточных, микроРНК были обнаружены во многих жидкостях организма. Кроме того, отл?…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780