Cerebrospinale vloeistof MicroRNA Profiling Met behulp van kwantitatieve real time PCR

Summary

We beschrijven een protocol van real time PCR om microRNA profileren in de cerebrospinale vloeistof (CSF). Met uitzondering van RNA-extractie protocollen kan de procedure worden uitgebreid tot RNA geëxtraheerd uit andere lichaamsvloeistoffen, gekweekte cellen of weefselmonsters.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) vormen een krachtige laag van genregulatie door het begeleiden van RISC naar sites op mRNA's richten en bijgevolg door het moduleren van hun translationeel repressie. Veranderingen in miRNA expressie bleken te worden betrokken bij de ontwikkeling van belangrijke complexe ziekten. Voorts recente bevindingen toonden aan dat miRNAs kan worden afgescheiden aan het extracellulaire milieu en in de bloedbaan en andere lichaamsvloeistoffen waar ze kunnen circuleren met een uitstekende stabiliteit. De functie van dergelijke circulerende miRNAs grotendeels ongrijpbaar, maar systematische hoge doorvoer benaderingen zoals miRNA profilering arrays, hebben geleid tot de identificatie van miRNA handtekeningen in verschillende pathologische aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve stoornissen en verscheidene soorten kanker. In dit verband, de identificatie van miRNA expressie profiel in de cerebrospinale vloeistof, zoals gerapporteerd in onze recente studie maakt miRNAs aantrekkelijke kandidaten voor biomerkeranalyse.

_content "> Er zijn verschillende tools beschikbaar voor het profileren van microRNA's, zoals microarrays, kwantitatieve real-time PCR (qPCR), en diepe sequencing. We beschrijven hier een gevoelige methode om microRNA's in de cerebrospinale vloeistof profileren door kwantitatieve real-time PCR. We gebruikte Exiqon microRNA kant-en-klare PCR menselijke panels I en II V2.R, waardoor detectie van 742 unieke menselijke microRNA. We voerden de arrays in drievoud uitgevoerd en we verwerkt en geanalyseerd gegevens met de GenEx Professional 5 software.

Met dit protocol, hebben we met succes geprofileerd miRNA bij diverse cellijnen en primaire cellen, CSF, plasma, en met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsels.

Introduction

MicroRNAs behoren tot de familie van de kleine (21-23 nt in de lengte) niet-coderende RNA's die genexpressie post-transcriptie regelen. microRNA kunnen worden uitgescheiden in de extracellulaire ruimte waar ze lijken relatief stabiel. Bij het bepalen van veranderingen in miRNA expressie kan een belangrijke stap in de richting van de identificatie van biomarkers zijn, het uitvoeren van miRNA profielen en het hanteren van een grote hoeveelheid gegevens kan intimiderend zijn.

Hier beschrijven we een protocol om veranderingen in miRNA expressie in de cerebrospinale vloeistof (voor andere lichaamsvloeistoffen) een gevoelige real time PCR te bepalen. We hebben het gebruik van software beschrijven ook voor gegevensanalyse, zoals statistische analyse en grafische weergave van de resultaten. De gehele procedure is relatief eenvoudig en ongecompliceerd en, afhankelijk van het aantal monsters dat moet worden geprofileerd en het aantal real time PCR machines beschikbaar, ook relatief snel. Het experimentele gedeelte vereist nauwkeurigheid bij het verwerkenRNA en pipetteren in 384-wells platen, terwijl de sectie analyse met behulp GenEx vereist enige basiskennis informatica en statistiek.

Protocol

Het volgende protocol beschrijft de standaard procedure voor het isoleren van RNA uit CSF en het profiel van microRNA's met behulp klaar PCR-platen. Merk op dat de organische fase extractie is optioneel, en dat een drager RNA wordt aan het monster toegevoegd tijdens de extractie om een ​​maximale terugwinning van RNA. Bijgevolg hoeft het RNA te kwantificeren. Kortom, kan een gemiddelde van 6-8 platen worden uitgevoerd in een dag of de dag cDNA gesynthetiseerd voor (ongeveer 2 uur). A…

Representative Results

De resultaten van deze studie zijn eerder gepubliceerd 1. Figuur 1 toont resultaten uit de analyse van kandidaatreferentiemateriaal microRNA middels geNorm toepassing. Dienovereenkomstig twee microRNA, miR-622 en miR-1266, werden als referentie genen en werden gebruikt miRNA waarden normaliseren. Voor de GSK-studie hadden we drie groepen van monsters: HIV-(n = 10), bijenkorf (n = 4), en HIV + zonder Encefalitis (HIV +, n = 5). De twee gr…

Discussion

MicroRNA zijn kleine niet-coderende RNA's die genexpressie reguleren door het remmen van vertaling en / of het bevorderen van mRNA degradatie ^2. Door hun grote stabiliteit in celvrije voorwaarden zijn microRNA ontdekt in veel lichaamsvloeistoffen. Bovendien is duidelijk expressieprofiel van microRNA gecorreleerd met fase en / of progressie van een verscheidenheid van menselijke kankers ^3-9.

Er zijn verschillende tools beschikbaar om microRNA profiel, met inbegrip va…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780