Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

Summary

Wir beschreiben ein Protokoll der Echtzeit-PCR, um microRNAs in der Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit (CSF) zu profilieren. Mit Ausnahme von RNA-Extraktionsprotokollen kann der Vorgang um RNA aus anderen Körperflüssigkeiten, Zellkulturen oder Gewebeproben extrahiert verlängert werden.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) sind eine starke Schicht der Genregulation Führungs RISC zu Seiten mRNAs Ziel befindet und somit durch Modulation ihrer translationale Repression. Änderungen in der miRNA-Expression wurde gezeigt, dass bei der Entwicklung von allen großen komplexen Erkrankungen beteiligt sein. Darüber hinaus zeigten neuere Erkenntnisse, dass miRNAs an die extrazelluläre Umgebung sezerniert werden und in die Blutbahn und anderen Körperflüssigkeiten, wo sie mit hoher Stabilität zirkulieren kann. Die Funktion eines solchen zirkulierenden miRNAs bleibt weitgehend ungeklärt, aber systematische Hochdurchsatz-Methoden, wie z. B. miRNA-Profiling Arrays haben zur Identifizierung von miRNA-Signaturen in verschiedenen pathologischen Bedingungen, einschließlich der neurodegenerativen Erkrankungen und einige Krebsarten führen. In diesem Zusammenhang ist die Identifizierung von miRNA-Expressionsprofils in der Cerebrospinalflüssigkeit, wie in unserer jüngsten Studie berichtet, macht miRNAs attraktive Kandidaten für Biomarker-Analyse.

_content "> Es gibt verschiedene Tools für die Profilierung von microRNAs, wie Microarrays zur Verfügung, quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) und deep sequencing. Hier beschreiben wir eine empfindliche Methode, um microRNAs in Liquor durch quantitative Echtzeit-PCR-Profil. Wir verwendet die Exiqon microRNA ready-to-use PCR menschlichen Platten I und II V2.R, die ermöglicht den Nachweis von 742 einzigartige menschliche microRNAs. Wir führten die Arrays in dreifacher Ausfertigung läuft und wir verarbeitet und analysiert Daten mit der Genex Professional 5 Software.

Über dieses Protokoll, haben wir erfolgreich in verschiedenen Arten von Zelllinien und Primärzellen, Liquor, Plasma und Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Geweben Profil microRNAs.

Introduction

MicroRNAs gehören zu der Familie der kleinen (21-23 nt Länge) nicht-kodierenden RNAs die Genexpression posttranskriptional regulieren. Mikro-RNAs in den extrazellulären Raum, in dem sie erscheinen, relativ stabil zu sein, sezerniert werden. Während Bestimmung von Veränderungen in der miRNA-Expression kann ein wichtiger Schritt zur Identifizierung von Biomarkern sein, die Durchführung miRNA-Profile und Handhabung einer großen Menge von Daten kann einschüchternd sein.

Hier beschreiben wir ein Protokoll von Änderungen in miRNA-Expression in der Zerebrospinalflüssigkeit von einem empfindlichen Echtzeit-PCR (für andere Körperflüssigkeiten) zu bestimmen. Wir beschreiben auch die Verwendung von Software für die Datenanalyse, einschließlich der statistischen Auswertung und grafische Darstellung der Ergebnisse. Das gesamte Verfahren ist relativ einfach und unkompliziert und in Abhängigkeit von der Anzahl der Proben, die profiliert werden und die Anzahl von Echtzeit-PCR-Maschinen verfügbar sind, auch relativ schnell. Der experimentelle Teil erfordert Genauigkeit bei der HandhabungRNA und Pipettieren in 384-Well-Platten, während der Datenanalyse Abschnitt mit Genex erfordert einige Grundkenntnisse in Informatik und Statistik.

Protocol

Das folgende Protokoll beschreibt die Standard-Verfahren, um RNA aus GFK und Profil microRNAs mit fertigen PCR-Platten isolieren. Beachten Sie, dass die organische Extraktionsphase ist optional, und daß ein Träger-RNA wird während der Extraktion gewährleistet eine maximale Rückgewinnung der RNA zu der Probe gegeben. Folglich gibt es keine Notwendigkeit, um die RNA zu quantifizieren. Insgesamt kann ein Durchschnitt von 6-8 Platten an einem Tag ausgeführt werden, wenn die cDNA am Tag zuv…

Representative Results

Die Ergebnisse dieser Studie wurden bereits veröffentlicht worden 1. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse aus der Analyse der Kandidatenreferenz microRNAs mit geNorm Anwendung. Dementsprechend zwei microRNAs, miR-622 und miR-1266, wurden als Referenzgene identifiziert und wurden verwendet, um miRNA Werte normalisieren. Für die CSF-Studie hatten wir drei Gruppen von Proben: HIV-(n = 10), HIVE (n = 4) und HIV + ohne Enzephalitis (HIV +, n = …

Discussion

MicroRNAs sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression regulieren, durch die Hemmung der Translation und / oder die Förderung der mRNA-Abbau ^2. Aufgrund ihrer hohen Stabilität in zellfreien Bedingungen haben microRNAs in vielen Körperflüssigkeiten nachgewiesen worden. Außerdem hat deutliche Expressionsprofil miRNAs mit Stufe und / oder Progression bei einer Vielzahl von menschlichen Krebsarten ^3-9 korreliert.

Es gibt verschiedene Tools zur Verfügung, u…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780