Isolamento e Preparação de Paredes Celulares Bacterianas para Análise Composicional por Cromatografia Líquida de Ultra Desempenho

Resumo

A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

Resumo

A parede celular bacteriana é fundamental para a determinação da forma celular durante o crescimento e divisão, e mantém a integridade mecânica das células diante das pressões turgor várias atmosferas em magnitude. Através das diversas formas e tamanhos do reino bacteriano, a parede celular é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos curtos. A importância central do peptidoglycan para a fisiologia bacteriana está por trás de seu uso como alvo antibiótico e motivou estudos genéticos, estruturais e biológicos celulares de como ele é fortemente montado durante o crescimento e divisão. No entanto, investigações extensas ainda são necessárias para caracterizar plenamente as principais atividades enzimáticas na síntese peptidoglycan e na composição química das paredes celulares bacterianas. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) é um poderoso método analítico para quantificar diferenças na composição química das paredes de bactérias cultivadas sob uma variedade de condições ambientais e genéticas, mas sua produção é muitas vezes limitada. Aqui, apresentamos um procedimento simples para o isolamento e preparação de paredes celulares bacterianas para análises biológicas de peptidoglycan via HPLC e Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), uma extensão do HPLC que utiliza bombas para fornecer pressões ultra-altas de até 15.000 psi, em comparação com 6.000 psi para HPLC. Em combinação com a preparação de paredes celulares bacterianas apresentadas aqui, os injetores de amostra de baixo volume, detectores com altas taxas de amostragem, volumes amostrais menores e tempos de execução mais curtos de UPLC permitirão alta resolução e throughput para novas descobertas de composição peptidoglycan e biologia celular bacteriana fundamental na maioria dos laboratórios biológicos com acesso a um ultracentrifuge e UPLC.

Introdução

O objetivo do método aqui descrito é isolar paredes celulares bacterianas intactas (sacculi) e digerir o peptidoglycan (PG) de modo que a Cromatografia Líquida Ultra Performance (UPLC) possa ser usada para fornecer informações como a identidade dos componentes do muropeptídeo e suas concentrações, o comprimento médio dos fios glicanos e a fração do material envolvido em crosslinks entre fios. Para uma discussão detalhada das espécies de bioquímica e muropeptídeos de PG, existem várias excelentes revisões que descrevem a estrutura pg e seu papel na infecção, resistência, morfogênese e crescimento^1-6. A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) para aná....

Protocolo

1. Cultivar culturas bacterianas em 2,5 ml de mídia durante a noite

Culturas de diluição de 1:100 em 250 ml de mídia fresca e crescem para OD₆₀₀ de 0,7-0,8. Prepare uma solução de 6% de sulfato de dodecyl de sódio (SDS) na água.

ATENÇÃO: O pó SDS é perigoso - evite inalar pó SDS; usar uma máscara sobre o nariz e a boca.

2. Dia 1 - Culturas Bacterianas Lysing é Realizada ao longo de um dia e durante a noite

1. Enquanto culturas diluídas estão crescendo, configure um banho de água fervente em um prato quente em um béquer 1 L. Uma vez que a água esteja fervendo, aliquot 6 ....

Resultados

Utilizando o procedimento descrito na Figura 1,a amostra final deve consistir em pelo menos 200 μl de solução clara que foi filtrada diretamente em um frasco UPLC (etapa 4.4). A separação uplc dos vários muropeptídeos em uma amostra bacteriana baseia-se em sua solubilidade relativa entre a fase móvel líquida e a fase estacionária da coluna. As colunas C18 de fase invertida fornecem uma matriz fortemente hidrofóbica para separar as espécies de muropeptídeos à base de hidroofobidade e tamanho⁸; .......

Discussão

Um passo crítico neste procedimento é a etapa 3.1 do segundo dia de preparação da amostra. Se o SDS precipitou durante a noite, ou se as amostras foram armazenadas em 4% de SDS por várias semanas em temperatura ambiente, as amostras devem ser rebovadas por pelo menos 1 hora para ressolar o SDS. Uma causa comum para a precipitação de SDS é o uso de mídia com sais de potássio, por isso o potássio deve ser evitado na mídia, se possível. Como mencionado na seção Resultados Representativos, também é fundamental ajustar o pH p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pronase E	Amresco	E629
Mutanolisina de Streptomyces	Sigma-Aldrich	M9901
Borohidreto de sódio (NaBH4)	Sigma-Aldrich	452882	O borohidreto de sódio é altamente reativo e perigoso de manusear
Ácido ortofosfórico	Sigma-Aldrich	79607	O ácido ortofosfórico é corrosivo e perigoso de manusear
bórico	Sigma-Aldrich	31146
Azida sódica	Sigma-Aldrich	S2002	A azida sódica é um veneno
Tetraborato de sódio	Sigma-Aldrich	221732
Millex 0,22 μ Filtros de seringa	Fisher	SLGVR04NL
tiras de pH (faixa de pH 0-6)	Fisher	M95863
50 ml polipropileno Falcon tubos	VWR	21008-951
tubos de vidro de 13 mm x 100 mm Kimble	Chase	60CM13
frasco de recuperação de vidro com gargalo de rosca de 12 mm x 32 mm	Waters	186000327C
Dodecil Sulfato de Sódio	Ambion	O pó de AM9820	SDS é perigoso
Águas da instrumentação
Gerente
UPLC de Acquity UPLC H-Class do coordenador
coluna m Detector
			de PDA Acquity UPLC Coletor
de Frações de Águas III
Acquity UPLC 30 cm Aquecedor / Resfriador

Ácido Acquity UPLC sistema da H-Classe, incluindo: da amostra da H-classe de Acquitysolvente quaternário Acquity UPLC BEH C18 1,7 µ de Coluna