फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी द्वारा एंटीफ्रीज प्रोटीन के आइस-बाइंडिंग विमानों का निर्धारण
Summary
एंटीफ्रीज प्रोटीन (AFPs) बर्फ के विशिष्ट विमानों को रोकने या धीमी बर्फ के विकास को रोकने के लिए बांधते हैं। फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी (FIPA) विश्लेषण एएफपी-बाध्य बर्फ विमानों के निर्धारण के लिए मूल बर्फ-नक़्क़ाशी विधि का एक संशोधन है । AFPs फ्लोरोसेंटी लेबल, स्थूल एकल बर्फ क्रिस्टल में शामिल हैं, और यूवी प्रकाश के तहत कल्पना की ।
Abstract
आंतरिक बर्फ के विकास को रोकने या धीमा करने के लिए विभिन्न प्रकार के ठंडे-हार्डी जीवों में एंटीफ्रीज प्रोटीन (एएफपी) व्यक्त किए जाते हैं। AFPs अपने बर्फ बाध्यकारी सतहों के माध्यम से बर्फ के विशिष्ट विमानों के लिए बांध । फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन एफ़िनिटी (FIPA) विश्लेषण एक संशोधित तकनीक है जिसका उपयोग बर्फ के विमानों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जिसके लिए AFPs बांधते हैं । FIPA एएफपी-बाध्य बर्फ विमानों का निर्धारण करने के लिए मूल बर्फ नक़्क़ाशी विधि पर आधारित है । यह एक छोटा प्रयोगात्मक समय में स्पष्ट छवियों का उत्पादन करता है। FIPA विश्लेषण में, AFPs फ्लोरोसेंट रूप से एक चिमरिक टैग या एक सहसंयोजक डाई के साथ लेबल किया जाता है, फिर धीरे-धीरे एक स्थूल एकल बर्फ क्रिस्टल में शामिल किया जाता है, जिसे गोलार्द्ध में पूर्वतृित किया गया है और ए-और सी-कुल्हाड़ियोंको निर्धारित करने के लिए उन्मुख किया गया है। एएफपी-बाध्य बर्फ गोलार्द्ध को यूवी लाइट के नीचे इमेज किया गया है ताकि एएफपी-बाध्य विमानों को गैर-विशिष्ट प्रकाश को अवरुद्ध करने के लिए फिल्टर का उपयोग करके कल्पना की जा सके । AFPs के फ्लोरोसेंट लेबलिंग बर्फ में एएफपी सोखने की वास्तविक समय निगरानी की अनुमति देता है । लेबल उन विमानों को प्रभावित नहीं करने के लिए पाए गए हैं, जिनके लिए AFPs बांधते हैं । FIPA विश्लेषण भी एक ही बर्फ क्रिस्टल पर एक से अधिक अलग टैग एएफपी बांधने के लिए मदद करने के लिए अपने बाध्यकारी विमानों अंतर विकल्प का परिचय । FIPA के इन अनुप्रयोगों के लिए कैसे AFPs बर्फ के लिए बांध अपने विकास को रोकने के लिए और क्यों कई एएफपी उत्पादक जीवों कई एएफपी isoforms व्यक्त की हमारी समझ अग्रिम मदद कर रहे हैं ।
Introduction
एंटीफ्रीज प्रोटीन (एएफपीएस) का उत्पादन कुछ जीवों का एक महत्वपूर्ण अस्तित्व तंत्र है जो बर्फ से लदे वातावरण में रहते हैं। हाल ही में जब तक, यह सोचा गया था कि AFPs का एकमात्र कार्य आंतरिक बर्फ क्रिस्टल के विकास को रोकना या धीमा करना था जो परिसंचरण को अवरुद्ध करेगा, ऊतक क्षति का कारण बनेगा, और ऑस्मोटिक तनाव। ऐसे जीव जो किसी भी हद तक ठंड बर्दाश्त नहीं कर सकते, जैसे मछली, बर्फ क्रिस्टल विकास को पूरी तरह से बाधित करने के लिए AFPs व्यक्त करते हैं1। घास जैसे अन्य लोग सहिष्णु को फ्रीज करते हैं और बर्फ के पुनर्क्रिस्टलाइजेशन को बाधित करने के लिए AFPs व्यक्त करते हैं जो उनके ऊतकों में बड़े बर्फ क्रिस्टल के गठन को कम करता है2। कम तापमान में झिल्ली का स्थिरीकरण एक और कार्य है जो एएफपीएस3के लिए सुझाया गया था । हाल ही में, बर्फ से ढकी खारी झीलों4से अंटार्कटिक जीवाणु, मैरिनोमोनास प्राइमोरिएन्सिसके एएफपी के लिए एक उपन्यास की भूमिका का सुझाव दिया गया था । यह एएफपी एक बहुत बड़ा आसॅ्टेसिन प्रोटीन5 का हिस्सा है जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों तक बेहतर पहुंच के लिए जीवाणु को बर्फ से जोड़ना माना जाता है6. अन्य रोगाणुओं को AFPs को स्रावित करने के लिए जाना जाता है, जो बर्फ की संरचना को बदल सकता है जिसमें वे7रहते हैं।
एएफपीएस कुछ मछली, कीड़े, पौधों, शैवाल, बैक्टीरिया, डायटोम, और कवक में पाया गया है। उनके पास विभिन्न अवसरों पर विभिन्न जनकों से उनके विकास के अनुरूप उल्लेखनीय भिन्न दृश्य और संरचनाएं हैं; और फिर भी वे सब बर्फ को बांध और सोखने-अवरोध तंत्र8द्वारा अपने विकास को बाधित . एएफपीएस प्रत्येक की एक विशिष्ट सतह होती है जो इसकी आइस-बाइंडिंग साइट (आईबीएस) के रूप में कार्य करती है। इन्हें आम तौर पर सतह अवशेषों9-11के साइट-निर्देशित म्यूटेगेनिसिस द्वारा पहचाना जाता है। आईबीएस बर्फ की तरह पैटर्न है कि बर्फ के विशिष्ट विमानों से मेल खाता है में पानी के अणुओं की व्यवस्था करने के लिए परिकल्पना की है । इस प्रकार एएफपी5, 12के लिए बाध्यकारी से पहले अपनी ligand रूपों । बर्फ विमानों को उनके मिलर सूचकांकों द्वारा परिभाषित किया जा सकता है, और विभिन्न AFPs विभिन्न विमानों के लिए बाध्य कर सकते हैं । इस प्रकार, प्रकार मैं एएफपी सर्दियों से 20-21 पिरामिड विमानों को बांधता है13,प्रकार III एएफपी एक यौगिक बर्फ बाध्यकारी सतह11,14का उपयोग कर प्राथमिक चश्मे और पिरामिड विमानों दोनों बांधता है, जबकि सजाना बुडवार एएफपी, एक अतिसक्रिय एएफपी, प्राथमिक और बेसल दोनों विमानों के लिए एक साथ बांधता है15,16। अन्य अतिसक्रिय AFPs, जैसे कि एमपीएएफपी, कई बर्फ विमानों से बांधते हैं, जैसा कि एकल बर्फ क्रिस्टल गोलार्द्धों5,17के अपने पूर्ण कवरेज द्वारा दिखाया गया है। यह परिकल्पना की गई है, कि बेसल विमान के साथ-साथ अन्य विमानों को बांधने के लिए अतिसक्रिय AFPs की क्षमता, मामूली रूप से सक्रिय AFPs 18 पर उनकी10गुना उच्च गतिविधि के लिए खाते में हो सकता है । हालांकि अतिसक्रिय AFPs की दक्षता अच्छी तरह से प्रलेखित है, उनके कई बर्फ विमानों को बांधने की क्षमता अभी भी समझ में नहीं आ रहा है ।
एएफपी-बाध्य बर्फ विमानों का निर्धारण करने के लिए मूल विधि चार्ल्स नाइट१३,१९द्वारा विकसित की गई थी । इस विधि में, एक स्थूल एकल बर्फ क्रिस्टल एक खोखले धातु रॉड (ठंडी उंगली) पर रखा जाता है और इसे एक गोलार्द्ध में जलमग्न करके एक गोलार्द्ध में बनता है जो डेगासेड पानी से भरा हुआ है। फिर, गोलार्द्ध AFPs के एक पतला समाधान में डूबे हुए है और बर्फ की एक परत कई घंटे ठंडी उंगली के माध्यम से घूम एथिलीन ग्लाइकोल के तापमान से नियंत्रित पर बर्फ क्रिस्टल गोलार्द्ध पर एएफपी समाधान से उगाया जाता है । बर्फ क्रिस्टल को समाधान से हटा दिया जाता है, ठंडी उंगली से अलग किया जाता है, और -10 से -15 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर कमरे में रखा जाता है। सतह को एंटीफ्रीज प्रोटीन समाधान की जमे हुए सतह फिल्म को हटाने के लिए एक तेज ब्लेड के साथ स्क्रैप किया जाता है और बर्फ क्रिस्टल को कम से कम 3 घंटे के लिए सब्लिमेट करने की अनुमति है। उदात्तीकरण के बाद, एएफपीएस से बंधे बर्फ विमानों को अवशिष्ट प्रोटीन से प्राप्त सफेद नक़्क़ाशी पैटर्न के रूप में देखा जा सकता है। बर्फ गोलार्द्ध को बर्फ के बेसल और चश्मे के विमानों का पता लगाने और नक़्क़ाशी पैच के मिलर सूचकांकों का निर्धारण करने के लिए अपने सी-अक्ष और एक-कुल्हाड़ियोंके लिए उन्मुख किया जा सकता है।
यहां हम बर्फ के एएफपी-बाध्य विमानों का निर्धारण करने के लिए मूल विधि के संशोधन का वर्णन करते हैं, एक विधि जिसे हम फ्लोरेसेंस आधारित आइस प्लेन ए आत्मीयता (FIPA)11के रूप में संदर्भित करते हैं । एएफपी को फ्लोरोसेंट रूप से या तो एक चिमरिक टैग के साथ लेबल किया जाता है, जैसे कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी)11,16,17,20,या फ्लोरोसेंट डाई के साथ सहसंयोजक रूप से एएफपी5,21से बंधे होते हैं। फ्लोरोसेंटी लेबल वाले एएफपीएस को एक ही बर्फ क्रिस्टल में सोख दिया जाता है और मूल बर्फ-नक़्क़ाशी प्रयोगों के रूप में एक ही प्रयोगात्मक प्रक्रिया का उपयोग करके ऊंचा हो जाता है। बढ़ती बर्फ गोलार्द्ध के लिए बाध्यकारी एएफपी की हद तक एक पराबैंगनी (यूवी) दीपक का उपयोग कर प्रयोग भर में निगरानी की जा सकती है । प्रयोग पूरा होने के बाद, गोलार्द्ध को सीधे ठंडी उंगली से दूर ले जाया जा सकता है और बिना किसी उदात्तीकरण के इमेज किया जा सकता है। हालांकि, यदि वांछित है, तो गोलार्द्ध को पारंपरिक बर्फ की कल्पना करने के लिए छोड़ दिया जा सकता है। FIPA पद्धति के लिए शुरू की संशोधनों कई घंटे से पारंपरिक बर्फ नक़्क़ाशी प्रोटोकॉल छोटा । इसके अतिरिक्त, एएफपी-बाध्य बर्फ विमानों के ओवरलैपिंग पैटर्न की कल्पना करने के लिए, एक अलग फ्लोरोसेंट लेबल के साथ एक साथ कई AFPs इमेजिंग की क्षमता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एएफपी के निर्धारण के लिए चार्ल्स नाइट द्वारा बर्फ नक़्क़ाशी विधि का विकास-बाध्य बर्फ विमानों ने AFPs द्वारा बर्फ बाध्यकारी के तंत्र पर बहुत उन्नत अध्ययन किया । जबकि AFPs की संरचनाओं एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLD प्रोटीन इंजीनियरिंग में कनाडा अनुसंधान कुर्सी रखती है । इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों से पीएलएडी के लिए अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था । इस काम को जापान सोसायटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) (नंबर 23310171) और जापान बायो ओरिएंटेड टेक्नोलॉजी रिसर्च एडवांसमेंट इंस्टीट्यूशन (ब्रेन) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए ग्रांट-इन-एड का भी समर्थन मिला । हम अग्रणी काम है कि FIPA के नेतृत्व के लिए Drs. क्रिस मार्शल और माइक Kuiper के लिए आभारी हैं । हम इस कार्य में से कुछ के लिए सुविधाएं प्रदान करने के लिए और फ्लोरोसेंट प्रकाश उमंग और उत्सर्जन फिल्टर स्थापित करने के लिए डॉ लॉरी ग्राहम को भी आभारी हैं ।
Materials
| NESLAB RTE Refrigerating Bath/Circulators | Thermo Scientific | RTE7 | |
| Ethylene glycol, Premixed Antifreeze/Coolant | Certified | 29-3037-0 | Common automotive antifreeze |
| Cold finger | not available | not available | Custom made with brass (9 cm long, 1.5 cm outer diameter) |
| Hemispherical cup | not available | not available | Custom made with resin (8 cm outer diameter, 6 cm inner diameter) |
| High Dual Output Lighting System | Lightools Research | LT-99D2, Illumatools DLS 120 volts AC, LT-9470FX, LT-9549FX | Additional and custom excitation filters can be purchased from Lightools Research |
| Camera | Canon | EOS 50D | |
| Emission Filters | Lightools Research | LT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVG | Filter ring adapter may be required to fit filter onto camera lens |
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