Proteom analyse av cochlea sensorisk epitel kan være utfordrende på grunn av sin lille størrelse og fordi membran proteiner er vanskelige å isolere og identifisere. Både membran og oppløselige proteiner kan identifiseres ved å kombinere flere preparative metoder og separasjonsteknikker sammen med høy-oppløsningsmassespektroskopi.
Proteomikk er en vanlig brukt metode som kan gi innsikt i komplekse biologiske systemer. Den cochlea sensorisk epitel inneholder reseptorer som transduce den mekaniske energien til lyd i en elektro-kjemisk energi som behandles av det perifere og sentrale nervesystem. Flere proteomic teknikker har blitt utviklet for å studere cochlea indre øret, slik som to-dimensjonale forskjell gelelektroforese (2D-DIGE), antistoff microarray, og massespektrometri (MS). MS er den mest omfattende og allsidig verktøy i proteomikk og i forbindelse med separasjonsmetoder kan gi en grundig proteomet av biologiske prøver. Separasjons metoder kombinert med MS har evnen til å berike proteinprøver, detektere lav molekylvekt og hydrofobe proteiner, og identifisere lave tallrike proteiner ved å redusere proteomet dynamisk område. Forskjellige fordøyelse strategier kan bli anvendt for å hel-lysat eller fraksjonert protein lysatet for å øke peptid-og proteinsekvens dekning. Utnyttelse av forskjellige separasjonsteknikker, inkludert sterk kationbytter (SCX), reversfase (RP), og gel-eluert væskefraksjon innesperring elektroforese (GELFrEE) kan anvendes for å redusere kompleksiteten prøven før MS-analyse for protein identifikasjon.
Proteomikk er studiet av kompliserte biologiske systemer ved å analysere proteinekspresjon, funksjon, modifikasjoner, og interaksjoner en. Flere metoder er blitt anvendt for proteom analyse av det indre øret, inkludert antistoffer microarray 2, to-dimensjonal gelelektroforese 3-5, og DIGE 6.. Men, har blitt identifisert og karakterisert 2,7-10, sammenlignet med over 10 000 gener og uttrykt sekvens tags (samle såkalte) identifiserte i det indre øret 11,12 bare et begrenset antall proteiner, er MS den mest brukte og omfattende teknikk i proteomikk for protein karakterisering. Analyse av komplekse proteomikk prøver, slik som i sneglehuset, kan være utfordrende. Imidlertid er kombinasjonen av flere separasjonsteknikker med MS muliggjør identifisering av et større antall av peptider og proteiner, på grunn av en økt dynamisk konsentrasjonsområde og maksimal kapasitet 13.. Flerdimensjonal kromatografiPHY reduserer svært komplekse proteinblandinger ved å tillate bruk av forskjellige adsorpsjon mekanismer. Det finnes to vanlige MS proteom analyse tilnærminger, hagle og bottom-up proteomikk. I shotgun proteomforskning, er en blanding av intakte proteiner enzymatisk spaltet og separert ved hjelp av flerdimensjonal kromatografi med sterk kation-byttekromatografi (SCX), etterfulgt av reversfase-væskekromatografi (Bytt ut) 14,15. De separerte peptider er utsatt for tandem MS og databasesøk 15.. En stor fordel med denne teknikken er at tusener av proteiner kan bli identifisert i en enkel analyse, og teknikken er bedre egnet til membranproteiner.
I den opp-ned-metode, blir proteinblandingen separeres, vanligvis ved en-eller todimensjonal elektroforese, og de enkelte proteinbånd eller flekker skåret ut og fordøyd med et enzym slik som trypsin, vanligvis resulterer i flere peptider. Men en annen nyerely utviklet elektro tilnærming, som brukes i bottom-up proteomikk, er GELFrEE. Denne teknikken fraksjonerer proteinprøver i væskefase og gjør dem mindre kompleks før analyse. Denne teknikken er reproduserbar, tilbyr høy protein utvinning, og reduserer fordelingen av høye rikelig proteiner i komplekse proteinprøver 16. Peptides, som følge av separerte proteinene blir analysert ved MS, ved hjelp av peptid-masse fingerprinting eller tandem MS (MS / MS), for å opprette sekvensen koder for database søker 17-19. Noen av de store fordelene med å bruke bottom-up tilnærming er muligheten til å få høyoppløselige separasjoner og omfattende protein dekning. Bottom-up proteomikk er den mest brukte teknikken i proteomikk 20, derav flere bioinformatikk verktøy er tilgjengelige. I tillegg kan proteinene bli separert i en kompleks blanding før fordøyelse, slik at det er større sannsynlighet for identifikasjon.
En av de store utfordringenei å bruke det indre øret for proteomikk analyser er dens liten størrelse, begrenset tilgjengelighet, og celletype mangfold 21. I tillegg er viktige proteiner som skiller dens funksjonalitet, slik som ionekanaler, transportører og reseptorer, er membranproteiner, som kan være vanskelig å isolere 22. Dermed er filter assistert prøveopparbeidelse (FASP) fordelaktig for proteomikk analyser av vev som er begrenset for protein utvinning og som krever vaskemidler til å oppløse membraner 23. Denne filtreringen gjør det mulig for MS-analyse av membran-og oppløselige proteiner, og for evnen til å isolere peptider fra lavmolekylære forurensninger 23,24.
Den nåværende protokollen beskriver brukte proteomikk tilnærminger som er kombinert og modifisering for å analysere både løselig og membran proteiner og å maksimere antallet protein IDer fra cochlea sensorisk epitel. Vi vil beskrive med hagle proteomikk med FASP multi-fordøyeion, ionebytterkromatografi, høy oppløsning MS, og dataanalyse. I tillegg vil vi beskrive bottom-up proteomikk med GELFrEE, FASP multi-fordøyelsen, høyoppløselig MS, og dataanalyse.
De viktigste fremgangsmåten for å maksimere protein identifikasjon av cochlea sensorisk epitel er: 1) bruk av flere endoproteinases for fordøyelsen, 2) bruken av flere separasjonsteknikker, og 3) bruk av en høy-oppløsnings masse-spektrometer. Anvendelsen av flere enzymer øker antallet peptider og forbedrer proteinsekvens dekning, og dermed øke antall identifiserte proteiner fra sneglehuset vev. Trypsin, den mest brukte protease gir effektiv og spesifikk spalting av proteiner, genererer peptider som er bra f…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Dr. Kent Seeley, direktør for Senter for Drug Discovery og innovasjon (CDDI) Proteomikk Kjerne Facility ved University of South Florida for bruk av dette anlegget. Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDCD stipend R01 DC004295 til BHAs
8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm × 10 cm |
DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
Formic acid | Fluka | 94318 | |
GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |