Снизу вверх и дробовик протеомики для идентификации Комплексную Cochlear Proteome
Summary
Протеом анализ кохлеарного сенсорного эпителия может оказаться непростой задачей из-за его небольшого размера и потому мембранные белки трудно выделить и идентифицировать. Оба мембрана и растворимые белки могут быть идентифицированы путем объединения нескольких препаративных методов и методик разделения вместе с масс-спектрометрии высокого разрешения.
Abstract
Протеомика является широко используемым подход, который может дать ответ на сложных биологических систем. Кохлеарный чувствующий эпителий содержит рецепторы, которые преобразовывают механическую энергию звука в электро-химической энергии, обработанного периферической и центральной нервной систем. Несколько протеомические методы были разработаны для изучения кохлеарный внутреннее ухо, например, двухмерным электрофорезом в геле (разница 2D-ПГЛП), антител микрочипов, и масс-спектрометрии (МС). MS является наиболее полным и универсальным инструментом в протеомики и в сочетании с методами разделения может обеспечить углубленный протеома биологических образцов. Методов разделения в сочетании с МС имеет возможность обогатить образцов белка, обнаруживать низкую молекулярную массу и гидрофобных белков, и определить низкие обильные белки путем уменьшения динамического диапазона протеома. Различные стратегии пищеварения могут быть применены ко всей лизата или фракционированного лизата белка для повышения пептид и белокохват последовательность. Использование различных методов разделения, в том числе сильного катионного обмена (SCX), обращенно-фазовой (RP), а также гель-электрофореза элюировали жидкой фракции улавливающего (GELFrEE) могут быть применены для уменьшения сложности образца перед анализом MS для идентификации белков.
Introduction
Протеомика является изучение сложных биологических систем на основе анализа экспрессии белка, функции, модификации и взаимодействия 1. Некоторые методы были использованы для протеомного анализа внутреннего уха, в том числе антител микрочипов 2, двухмерным электрофорезом в геле 3-5 и Dige 6. Тем не менее, только ограниченное число белков были идентифицированы и охарактеризованы 2,7-10, по сравнению с более чем 10000 генов и выраженных тегов последовательности (ЭБТ), определенных во внутреннем ухе 11,12, MS является наиболее распространенным и всеобъемлющим техника в протеомики для белка характеристики. Анализ сложных протеомических образцов, таких как улитки, может быть сложной задачей. Тем не менее, сочетание нескольких методов разделения с МС позволяет идентифицировать большее количество пептидов и белков, из-за повышенного диапазона динамического концентрации и пиковой мощности 13. Многомерные хроматограPHY уменьшает весьма сложные белковые смеси, позволяя использование различных механизмов адсорбции. Есть два широко используемых MS подходы анализа протеома, дробовик и снизу вверх протеомика. В дробовика протеомики, смесь интактных белков ферментативно переваривается и разделены с использованием многомерного хроматографии с сильной катионообменной хроматографии (SCX), а затем обращенно-фазовой жидкостной хроматографией (ОФЖХ) 14,15. Отделенные пептиды подвергают тандемной MS и поиска в базе данных 15. Основным преимуществом этого метода является то, что тысячи белков могут быть определены в одном анализе и метод лучше подходит для мембранных белков.
В снизу вверх, смесь белок отделяется, как правило, одно-или двухмерного электрофореза, а отдельные полосы белка или пятна вырезали и переваривают с ферментом, таким как трипсин, как правило, в результате чего несколько пептидов. Тем не менее, другой более поздниелы разработан электрофоретическую подход, используемый в восходящих протеомики, является GELFrEE. Этот метод фракционируют образцов белка в жидкой фазе и делает их менее сложными до анализа. Этот метод воспроизводимым, предлагает высокое извлечение белка и уменьшает распределение высоких обильных белков в сложных белковых образцов 16. Пептиды, в результате, разделенных белков, анализируются с помощью МС, с помощью пептидной массовой дактилоскопии или тандем MS (MS / MS), для создания тегов последовательности для поиска в базе данных 17-19. Некоторые из основных преимуществ использования подхода снизу вверх являются возможность получения разделения с высоким разрешением и всеобъемлющий охват белка. Восходящие протеомика является наиболее широко используемым методом в протеомики 20, следовательно, несколько биоинформатики инструменты доступны. Кроме того, белки могут быть разделены в сложной смеси перед пищеварения, так что есть большая вероятность идентификации.
Одна из основных проблем,при помощи внутреннего уха для протеомного анализа является ее небольшой размер, ограничивается доступность и тип клеток разнообразие 21. Кроме того, ключевые белки, которые отличают его функциональность, такие как ионные каналы, перевозчиков и рецепторов, являются мембранные белки, которые могут быть трудно выделить 22. Таким образом, подготовка проб фильтр автоматизированного (ФАСП) является выгодным для протеомных анализа тканей, которые ограничены для извлечения белка и которые требуют моющие средства для растворения мембраны 23. Этот фильтр позволяет MS анализа мембраны и растворимых белков и на способность выделения пептидов от низкой молекулярной массой загрязняющих веществ 23,24.
Настоящий протокол описывает часто используемые протеомических подходы, которые объединяются и изменены, чтобы проанализировать как растворимые, так и мембранные белки и максимально увеличить количество идентификаторов белка от кохлеарного сенсорного эпителия. Мы опишем с помощью дробовика протеомики с ФАСП мульти-дайджестион, ионообменной хроматографии, с высоким разрешением МС, и анализ данных. Кроме того, мы опишем снизу вверх протеомики с GELFrEE, FASP мульти-пищеварения, высокое разрешение MS, и анализа данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ключевые шаги к максимизации идентификации белка от кохлеарного сенсорного эпителия являются: 1) использование нескольких endoproteinases для пищеварения, 2) использование нескольких методов разделения, и 3) использование масс-спектрометра с высоким разрешением. Применение нескольких фер…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктора Кента Сили, директор Центра по борьбе с наркотиками открытий и инноваций (CDDI) протеомика основной комплекс в Университете Южной Флориды для использования этого объекта. Эта работа была поддержана NIH / NIDCD гранта R01 DC004295 чтобы BHAS
Materials
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm × 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
Referências
- Domon, B., Aebersold, R. Review – Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
- Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
- Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
- Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. . The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).
- Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
- Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
- Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
- Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. . Plos One. 6, (2011).
- Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
- Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
- Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
- Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
- Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
- Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
- Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
- Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down’ protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
- Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
- Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
- Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
- Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O’Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).
