De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma
Summary
Análisis del proteoma del epitelio sensorial coclear puede ser un reto debido a su pequeño tamaño y porque las proteínas de membrana son difíciles de aislar e identificar. Tanto la membrana y proteínas solubles se pueden identificar mediante la combinación de múltiples métodos de preparación y técnicas de separación junto con espectrometría de masas de alta resolución.
Abstract
La proteómica es un enfoque de uso común que puede proporcionar conocimientos sobre los sistemas biológicos complejos. El epitelio sensorial coclear contiene receptores que transducen la energía mecánica del sonido en una energía electro-química procesada por los sistemas nerviosos periférico y central. Varias técnicas de proteómica se han desarrollado para estudiar el oído interno coclear, tales como la electroforesis bidimensional en gel de diferencia (2D-DIGE), microarrays de anticuerpos, y espectrometría de masas (MS). MS es la herramienta más completa y versátil en proteómica y en conjunto con los métodos de separación puede proporcionar un proteoma en profundidad de las muestras biológicas. Métodos de separación combinadas con EM tiene la capacidad de enriquecer las muestras de proteínas, detección de bajo peso molecular y proteínas hidrofóbicas, y identificar las proteínas de baja abundancia mediante la reducción de la gama dinámica proteoma. Diferentes estrategias de digestión se pueden aplicar a toda lisado o a proteínas de lisado fraccionado para mejorar péptido y proteínascobertura de secuencia. La utilización de diferentes técnicas de separación, incluyendo intercambio catiónico fuerte (SCX), de fase inversa (RP), y la electroforesis en gel de fracción de atrapamiento de líquido-se eluyó (GELFrEE) se puede aplicar para reducir la complejidad de la muestra antes del análisis de MS para la identificación de proteínas.
Introduction
La proteómica es el estudio de sistemas biológicos complejos mediante el análisis de la expresión de proteínas, la función, las modificaciones y las interacciones 1. Varios métodos han sido utilizados para el análisis del proteoma del oído interno, incluyendo el anticuerpo de microarrays 2, electroforesis bidimensional en gel de 3-5, y DIGE 6. Sin embargo, sólo un número limitado de proteínas se han identificado y caracterizado 2,7-10, en comparación con los más de 10.000 genes y las etiquetas de secuencias expresadas (EST) identificados en el oído interno 11,12, MS es la técnica más utilizada integral y en proteómica para la caracterización de proteínas. Análisis de muestras proteómicos complejas, tales como la cóclea, puede ser un reto. Sin embargo, la combinación de múltiples técnicas de separación con MS permite la identificación de un mayor número de péptidos y proteínas, debido a un mayor rango dinámico y la capacidad de concentración pico 13. Cro MultidimensionalPHY reduce mezclas de proteínas altamente complejas, al permitir el uso de diferentes mecanismos de adsorción. Hay dos enfoques de análisis MS proteoma de uso común, la escopeta y la proteómica de abajo hacia arriba. En proteómica escopeta, una mezcla de proteínas intactas se digiere enzimáticamente y se separó mediante cromatografía multidimensional con fuerte cromatografía de intercambio catiónico (SCX), seguido de cromatografía líquida en fase inversa (RPLC) 14,15. Los péptidos separados son sometidas a tándem MS y base de datos de búsqueda 15. Una ventaja principal de esta técnica es que miles de proteínas pueden ser identificadas en un solo análisis y la técnica es más adecuada para las proteínas de membrana.
En el enfoque de abajo arriba, la mezcla de proteínas se separa, por lo general por una o electroforesis de dos dimensiones, y las bandas de proteínas individuales o puntos cortado y digerido con una enzima tal como tripsina, por lo general resulta en múltiples péptidos. Sin embargo, otra más recientely desarrolló enfoque electroforética, utilizado en la proteómica de abajo hacia arriba, es GELFrEE. Esta técnica fracciona muestras de proteínas en fase líquida y los hace menos complejo antes del análisis. Esta técnica es reproducible, ofrece una alta recuperación de proteína, y reduce la distribución de las proteínas abundantes altas en las muestras de proteínas complejas 16. Péptidos derivados de proteínas separadas, se analizan por EM, mediante el uso de huellas másicas de péptidos o MS en tándem (MS / MS), para crear etiquetas de secuencia para la búsqueda de base de datos 17-19. Algunas de las principales ventajas de utilizar el enfoque de abajo hacia arriba son la capacidad de obtener separaciones de alta resolución y cobertura de la proteína completa. Proteómica abajo hacia arriba es la técnica más utilizada en proteómica 20, por lo tanto, varias herramientas bioinformáticas disponibles. Además, las proteínas se pueden separar en una mezcla compleja antes de la digestión, por lo que hay una mayor probabilidad de identificación.
Uno de los principales retosen el uso de el oído interno para el análisis proteómico es su pequeño tamaño, accesibilidad restringida, y el tipo de células diversidad 21. Además, las proteínas clave que distinguen su funcionalidad, tales como los canales iónicos, transportadores y receptores, son proteínas de membrana, que pueden ser difíciles de aislar 22. Por lo tanto, la preparación de muestras de filtro asistido (FASP) es ventajoso para los análisis proteómicos de tejidos que están limitados para la extracción de la proteína y que requieren detergentes para solubilizar las membranas 23. Este filtrado permite el análisis de MS de membrana y proteínas solubles y para la capacidad de aislar péptidos a partir de los contaminantes de bajo peso molecular 23,24.
El presente protocolo describe enfoques proteómicos comúnmente utilizados que se combinan y modificar para analizar proteínas tanto solubles y de membrana y para maximizar el número de ID de la proteína a partir del epitelio sensorial coclear. Vamos a describir el uso de la proteómica escopeta con FASP múltiples digeririónico, cromatografía de intercambio iónico, MS de alta resolución, y el análisis de datos. Además, vamos a describir la proteómica de abajo hacia arriba con GELFrEE, FASP multi-digestión, MS de alta resolución, y el análisis de datos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos clave para maximizar la identificación de proteínas a partir del epitelio sensorial coclear son: 1) el uso de múltiples endoproteinasas para la digestión, 2) uso de múltiples técnicas de separación, y 3) la utilización de un espectrómetro de masas de alta resolución. La aplicación de múltiples enzimas aumenta el número de péptidos y mejora la cobertura de secuencia de la proteína, por lo tanto, mejorar el número de proteínas identificadas a partir del tejido coclear. Tripsina, la proteas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Kent Seeley, Director del Centro para el Descubrimiento de Medicamentos e Innovación (CDDI) Facilidad de Proteómica de la Universidad del Sur de Florida para el uso de este servicio. Este trabajo fue apoyado por la beca NIH / NIDCD R01 DC004295 a BHAS
Materials
| 8% Tris-acetate cartridge | Protein Discovery | 42103 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitrile | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Bovine serum albumin | BioRad | 500-0112 | |
| C18 column | New Objective | A25112 | 75 μm × 10 cm |
| DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | Microplate Assay Protocol |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinase Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Protein Digestion Kit | Protein Discovery | 44250 | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| GELFrEE Fractionation System | Protein Discovery | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptin | Calbiochem | 108975 | |
| MacroSpin Column | The Nest Group | SMM SS18V | Silica C18 |
| Microcystin | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatin | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Polysulfoethyl A Column | The Nest Group | 202SE0503 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sonic Dismembrator | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T6567 | Proteomics Grade |
Referências
- Domon, B., Aebersold, R. Review – Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
- Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
- Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
- Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. . The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).
- Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
- Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
- Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
- Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. . Plos One. 6, (2011).
- Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
- Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
- Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
- Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
- Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
- Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
- Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
- Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down’ protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
- Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
- Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
- Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
- Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
- Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
- Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
- Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O’Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).
