ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal
Summary
confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.
Abstract
זמן לשגות הדמיה היא טכניקה המאפשרת תצפית הישירה של תהליך המורפוגנזה, או הדור של צורה. בשל הבהירות האופטית שלהם ורמת מוכנות למניפולציה גנטית, עובר דג הזברה הפך אורגניזם מודל פופולרי שבה לביצוע ניתוח הזמן לשגות של המורפוגנזה בעוברי חיים. ההדמיה confocal של עובר דג הזברה לחיות דורשת כי רקמה של עניין היא שכותרתו בהתמדה עם סמן פלואורסצנטי, כגון transgene או צבע שהוחדר. התהליך דורש כי העובר הוא הרדים ושנערך במקום בצורה כזאת, שהתפתחות בריאה ממשיכה כרגיל. פרמטרים להדמיה חייבים להיות מוגדרים חשבון לצמיחה תלת ממדים וכדי לאזן את הדרישות של פתרון תאים בודדים תוך קבלת תמונות מהירות של פיתוח. התוצאות שלנו מראות את היכולת לבצע לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo של עוברי דג הזברה שכותרתו הקרינה ולזהות התנהגויות רקמה מגוונות בהרכס עצבי הגולגולת שגורמים למומי craniofacial. עיכובים התפתחותיים הנגרמים על ידי הרדמה והרכבה הם מינימאליים, והם עוברים ללא פגע על ידי התהליך. ניתן להחזיר עובר זמן לשגות הדמיה למדיום נוזלי ולאחר מכן צילם או קבוע בנקודות מאוחרות יותר בהתפתחות. עם שפע הולך וגדל של קווים מהונדסים דג הזברה ומיפוי גורל מאופיין היטב וטכניקות השתלה, הדמיה כל רקמה רצויה אפשרית. ככזה, זמן לשגות בתחום ההדמיה vivo משלב עוצמה עם שיטות גנטיות דג הזברה, כוללים ניתוחים של עוברים שעברו מוטציה וmicroinjected.
Introduction
המורפוגנזה Craniofacial היא תהליך רב שלבים מורכב הדורש אינטראקציות מתואמות בין סוגי תאים מרובים. רוב שלד craniofacial נגזר מתאי רכס עצביים, שרבים מהם חייבים לעבור מ הצינור העצבי הגבי למבנים ארעיים שנקראים קשתות בלוע 1. כמו ברקמות רבות, המורפוגנזה של שלד craniofacial היא יותר מסובכת ממה יכול להיות מובן על ידי תמונות סטטיות של עוברים בנקודות זמן ההתפתחותי ספציפיות. למרות שזה הוא לבצע זמן רב, in vivo מיקרוסקופיה זמן לשגות מספקת מבט מתמשך בתאים של עובר המתפתח ורקמות. כל תמונה בסדרת הזמן לשגות מעניקה הקשר לאחרים, ומסייעת למהלך חוקר לכיוון של הסקה מדוע תופעה מתרחשת ולא הסיק את מה שמתרחש באותו זמן.
בתחום ההדמיה vivo הוא אפוא כלי תיאורים רב עוצמה לגישות ניסיוניות ללפרק את המסלולים המנחים המורפוגנזה. Rerio Danio דג הזברה הוא מודל גנטי פופולרי של התפתחות עוברית של בעלי החוליות, והוא מתאים במיוחד גם בתחום ההדמיה vivo של המורפוגנזה. מודרני, שיטות נוחים לtransgenesis ושינוי גנומי הן מתקדמות במהירות מספר הכלים העומדים לרשות חוקרי דג הזברה. כלים אלה לשפר את השיטות חזקות כבר למניפולציה ומיקרוסקופיה גנטיות. בvivo הדמיה של כמעט כל רקמה בכמעט כל קשר גנטי רצוי היא קרובה יותר למציאות מאשר לדמיון.
תנועות morphogenetic של קשתות בלוע הם מודרכים על ידי איתות אינטראקציות בין הרכס העצבי והאפיטל הסמוך, שניהם האאקטודרם והאנדודרם. ישנן מולקולות רבות איתות שהביעו האפיטל כי יש צורך לנהוג המורפוגנזה של אלמנטי שלד craniofacial. בין מולקולות האיתות הללו, סוניק קיפוד (ששש) הוא f החשובה באופן קריטיאו פיתוח craniofacial 2-8. ששש מתבטאים בשני האאקטודרם הפה ובלוע האנדודרם 2,6,9,10. הביטוי של ששש בהאנדודרם מסדיר תנועות morphogenetic של הקשתות 10, דפוסים של רכס עצבי בתוך הקשתות 10, וצמיחה של שלד craniofacial 11.
איתות bmp היא גם חשובה באופן קריטי לפיתוח craniofacial 12 ועשויה לשנות המורפוגנזה של קשתות בלוע. איתות bmp מסדירה גב / הגחון דפוסים של רכס בתוך קשתות בלוע 13,14. שיבוש של smad5 בדג הזברה גורם למומי חיך קשים וכישלון של סחוסים של המקלה הפתיל כראוי על קו האמצע 15. בנוסף, מוטציות גם להציג ירידות ואיחוי באלמנטי סחוס הגחון, עם nd 2, 3 rd, ולפעמים אלמנטי קשת בלוע 4 ה התמזגו בקו האמצע 15. שילובים אלו ממליצים כי איתות Bmp מכוונת המורפוגנזה של אלמנטי בלוע אלה.
איתות PDGF היא הכרחית להתפתחות craniofacial, אבל יש לו תפקידים ידועים בהמורפוגנזה קשת בלוע. עכבר ומוטציות PDGFRA דג הזברה לשניהם יש clefting midfacial העמוק 16-18. לפחות בדג הזברה clefting midfacial זאת בשל כישלונה של נדידת תאי רכס עצביים תקינה 16. תאי רכס עצביים ממשיכים להביע PDGFRA אחרי שהם נכנסו לקשתות בלוע. בנוסף, ligands PDGF באים לידי ביטוי על ידי epithelia פנים ובתוך קשתות בלוע 16,19,20, ובכך איתות PDGF יכולה גם לשחק תפקיד בהמורפוגנזה של קשתות בלוע בעקבות הגירה. עם זאת, ניתוח של המורפוגנזה של קשתות בלוע במוטנטים PDGFRA לא בוצעו.
הנה, אנחנו מדגימים במיקרוסקופיה confocal vivo של pharyngulבשלב דג הזברה מהונדס ולתאר את המורפוגנזה של קשתות בלוע בתוך תקופה זו. בנוסף, אנו מראים התנהגויות רקמה שמושפעות על ידי מוטציות המשבשות את BMP, PDGF, ומסלולי איתות ששש.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות היא כלי רב עוצמה לניתוח של התפתחות. הנה, אנחנו מדגימים את התועלת של השיטה בלימוד המורפוגנזה קשת בלוע בדג זברה שהן מוטציה למסלולי איתות חשובות באמצעות מהונדס כי תוויות בתאי רכס עצביים. בנוסף לרמת רקמת ניתוחים, ניתוחי זמן לשגות תקפים גם לניתו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למליסה גריפין וג'נה Rozacky לטיפול דגי המומחה שלהם. הודות PDM EGN לכתיבת סיוע, נדיבות, וסבלנות. עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIDCR R01DE020884 לJKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Referências
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
