Analysera Kraniofaciala Morphogenesis i Zebrafish Använda 4D konfokalmikroskopi
Summary
Time-lapse konfokal avbildning är en kraftfull teknik användbar för karakterisering av embryots utveckling. Här beskriver vi den metod och karakterisera craniofacial morfogenes i vildtyp, samt PDGFRA, smad5 och SMO mutanta embryon.
Abstract
Time-lapse avbildning är en teknik som gör det möjligt att direkt observation av processen för morfogenes, eller generering av formen. På grund av deras optiska klarhet och mottaglighet för genetisk manipulation, har den zebrafisk embryot blivit en populär modell organism med för att utföra tidsförlopp analys av morfogenes i levande embryon. Konfokal avbildning av ett levande zebrafisk embryo kräver att en vävnad av intresse är ihärdigt märkt med en fluorescerande markör, såsom en transgen eller injiceras färgämnet. Processen kräver att embryot bedövas och hålls på plats på ett sådant sätt att en sund utveckling fortskrider normalt. Parametrar för avbildning måste ställas till svars för tredimensionell tillväxt och för att balansera kraven på att lösa enskilda celler samtidigt få snabba ögonblicksbilder av utveckling. Våra resultat visar att förmågan att utföra långsiktiga in vivo avbildning av fluorescensmärkta zebrafisk embryon och för att upptäcka olika vävnads beteenden ihjärn neurallisten som orsakar kraniofaciala missbildningar. Utvecklings förseningar orsakade av anestesi och montering är minimala, och embryon är oskadd genom processen. Time-lapse avbildade embryon kan returneras till flytande medium och därefter avbildas eller fast vid senare punkter i utvecklingen. Med ett ökande överflöd av transgena zebrafisk linjer och väldefinierad öde kartläggning och transplantationsteknik, bildbehandling varje önskad vävnad är möjlig. Som sådan, tidsförlopp in vivo imaging kombinerar kraftfullt med zebrafisk genetiska metoder, inklusive analyser av muterade och mikroinjicerade embryon.
Introduction
Craniofacial morfogenes är en komplex process i flera steg som kräver koordinerade interaktioner mellan multipla celltyper. Majoriteten av kraniofaciala skelettet är härlett från neurallistceller måste många av som migrerar från den dorsala neuralröret i transienta strukturer som kallas pharyngeal valv 1. Som med många vävnader, är morfogenes av kraniofaciala skelett mer komplicerat än vad som kan förstås av statiska bilder av embryon vid specifika utvecklingsmässiga tidpunkter. Även om det är tidskrävande att utföra, ger in vivo-tidsförlopp mikroskopi en kontinuerlig titt på en utveckling av embryo celler och vävnader. Varje bild i en time-lapse-serien ger sammanhang till de andra, och hjälper en utredare steget mot att kunna utläsa varför ett fenomen uppstår snarare än att kunna utläsa vad som händer då.
In vivo imaging är alltså ett kraftfullt beskrivande redskap för experimentella metoder fördekonstruera de vägar som styr morfogenes. I zebrafisk Danio rerio är en populär genetisk modell av vertebrat embryonal utveckling, och är särskilt väl lämpad för in vivo-avbildning av morfogenes. Modern är praktiska metoder för genmodifiering och genomisk modifiering snabbt framåt det antal verktyg tillgängliga för zebrafisk forskare. Dessa verktyg ökar redan robusta metoder för genetisk manipulation och mikroskopi. In vivo avbildning av nästan alla vävnader i nästan alla önskade genetiska sammanhang är närmare verkligheten än fantasin.
Morfogenetiska rörelser faryngala bågar styrs genom att signalera interaktioner mellan neurallisten och den intilliggande epitel, både ektoderm och endoderm. Det finns ett stort antal signalmolekyler som uttrycks av epitel som är nödvändiga för att driva den morfogenes av kraniofaciala skelettelement. Bland dessa signalmolekyler, Sonic Hedgehog (Shh) är mycket viktigt feller craniofacial utveckling 2-8. Shh uttrycks av både den muntliga ektoderm och svalg endoderm 2,6,9,10. Uttrycket av Shh i endoderm reglerar morfogenetiska rörelser av valven 10, mönstring av neurallisten inom bågarna 10, och tillväxten av den craniofacial skelett 11.
Bmp-signalering är också av avgörande betydelse för kraniofaciala utveckling 12 och kan ändra morfogenes av svalget valv. BMP signalering reglerar rygg / ventrala mönstring av crest inom faryngala valv 13,14. Avbrott i smad5 i zebrafisk orsakar allvarliga palatinala defekter och fel på Meckels brosk att smälta lämpligt vid mittlinjen 15. Dessutom mutanterna visar också minskningar och fusion i de ventrala brosk element, med 2: a, 3: e, och ibland 4: e svalg arch element smält vid mittlinjen 15. Dessa fusioner tyder starkt på att BMP signalering styr morfogenes av dessa svalg element.
PDGF-signalering är nödvändig för kraniofaciala utveckling, men har okända roller i svalg arch morfogenes. Både mus och zebrafisk PDGFRA mutanter har djupgående midfacial clefting 16-18. Åtminstone i zebrafisk denna midfacial clefting beror på ett bristfälligt neural crest cell migration 16. Neurallistceller fortsätter att uttrycka PDGFRA efter att ha anlänt faryngala valv. Dessutom är PDGF-ligander uttrycks av ansikts epitel och inom svalg valv 16,19,20, alltså PDGF-signalering kan också spela en roll i morfogenes av svalg valv efter migrationen. Men analyser av morfogenes av pharynx valv i PDGFRA mutanter har ej utförts.
Här visar vi in vivo konfokalmikroskopi av pharyngulen-stegs transgen zebrafisk och beskriva morfogenes av pharynx valv inom denna period. Vi visar ytterligare vävnads beteenden som påverkas av mutationer som stör BMP, PDGF, och Shh signalvägar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse konfokalmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för analys av utvecklingen. Här visar vi metodens användbarhet i att studera svalg båge morfogenes i zebrafisk som är mutant för viktiga signalvägar med hjälp av en transgen som märker neurallistceller. Förutom vävnadsnivå analyser, tid förfaller analyser gäller även för analyser på en cellulär skala 28. Många allmänt använda zebrafisk metoder kan också införlivas i tidsförlopp mikroskopi experiment, inklusive mikroinjektion av m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Melissa Griffin och Jenna Rozacky för sin fisk vård expert. PDM tack EGN för att skriva bistånd, generositet, och tålamod. Detta arbete stöddes av NIH / NIDCR R01DE020884 till JKE.
Materials
| 6 lb. test monofilament line | Cortland Line Company | SLB16 | |
| Agarose I | Amresco | 0710 | |
| Argon laser | LASOS Lasertechnik GmbH | LGN 3001 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID | FHC | 30-31-0 | |
| Clove oil | Hilltech Canada, Inc. | HB-102 | |
| High vacuum grease | Dow Corning | 2021846-0807 | |
| Isotemp dry-bath incubator | Fisher Scientific | 2050FS | |
| Laser scanning microscope | Carl Zeiss AG | LSM 710 | |
| Magnesium sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Microscope cover glass, 22×22-1 | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Microscope cover glass, 24×60-1 | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | M-11321 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | M-11624 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| TempController 2000-2 | PeCon GmbH | ||
| Tricaine-S | Western Chemical, Inc. |
Referências
- Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution. Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).
- Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
- Wada, N., et al. Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull. Development. 132, 3977-3988 (2005).
- Roessler, E., et al. Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly. Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).
- Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia. Genes Dev. 18, 937-951 (2004).
- Hu, D., Marcucio, R. S. A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm. Development. 136, 107-116 (2009).
- Cordero, D., et al. Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes. J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).
- Westphal, H., Beachyr, P. A. Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function. Nature. 383, 3 (1996).
- Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs. Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).
- Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton. Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).
- Balczerski, B., et al. Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors. Dev. Biol. , (2011).
- Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. BMP signalling in craniofacial development. Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).
- Alexander, C., et al. Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton. Development. 138, 5135-5146 (2011).
- Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton. Development. 138, 5147-5156 (2011).
- Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Examination of a palatogenic gene program in zebrafish. Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).
- Eberhart, J. K., et al. MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis. Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).
- Soriano, P. The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development. 124, 2691-2700 (1997).
- Tallquist, M. D., Soriano, P. Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells. Development. 130, 507-518 (2003).
- Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells. Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).
- Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development. Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches. PloS one. 8, e59533 (2013).
- Varga, Z. M., et al. Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation. Development. 128, 3497-3509 (2001).
- Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio. 1, 46-53 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning. Development. 131, 5703-5716 (2004).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).
