Isolation de Double Negative αβ cellules T du rein
Summary
Cellules DNabT sont rares chez les cellules T périphériques; cependant, ils sont abondants dans certains tissus non lymphoïdes. Difficulté d'isoler les cellules T DN à partir de tissus non lymphoïdes entrave leur analyse fonctionnelle malgré l'augmentation reconnu l'importance physiopathologique. Nous décrivons un nouveau protocole pour l'isolement de cellules T DN hautement purifiés à partir de rein de souris.
Abstract
Il n'existe actuellement aucun protocole standard pour l'isolement de cellules T DN à partir des tissus non lymphoïdes, malgré leur implication de plus en plus rapportée dans diverses réponses immunitaires. DN cellules T sont un type de cellule immunitaire unique qui a été impliquée dans la régulation des réponses immunitaires et de la tolérance aux allogreffes et auto-immunes 6.1. Cellules T DN sont cependant rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions rate et les ganglions), mais sont des résidents du rein normal. On sait très peu sur leur fonction physiopathologique 7 en raison de leur rareté dans la périphérie. Nous avons récemment décrit une analyse phénotypique et fonctionnelle complète de cette population dans le rein 8 dans l'état d'équilibre et pendant les lésions de reperfusion de l'ischémie. Analyse de la fonction des cellules T DN sera grandement améliorée par l'élaboration d'un protocole pour l'isolement du rein.
Ici, nous décrivons un nouveau protocole qui permet isolation de cellules hautement purs ab CD4 + CD8 + T et les cellules T DN du rein murin. En bref, nous digérer le tissu rénal en utilisant de la collagénase et d'isoler les cellules mononucléaires (rein) KMNC par gradient de densité. Ceci est suivi par deux étapes pour enrichir les cellules T hématopoïétiques de 3% à 70% de KMNC. La première étape consiste en une sélection positive des cellules hématopoïétiques CD45 + en utilisant un kit d'isolement. Dans la seconde étape, les cellules T sont isolées à DN négativement par élimination des cellules non désirées à l'aide de CD4, CD8, CMH de classe II et les anticorps monoclonaux et CD1d α-GalCer tétramère. Cette stratégie conduit à une population de plus de 90% de cellules T DN purs. la coloration de la surface avec les anticorps mentionnés ci-dessus, suivie par une analyse FACS est utilisée pour confirmer la pureté.
Introduction
Périphérique αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – double négatif cellules (DN) T sont divisés en différents sous-ensembles qui possèdent des phénotypes et des fonctions distinctes 1-4. Cellules T DN sont mal compris, mais de plus en plus impliqués dans les réponses immunitaires physiopathologiques dans différents modèles de maladies 4-6.
Cellules DN T sont un type de cellule immunitaire unique qui est de plus en plus impliqué dans la régulation de diverses réponses immunitaires et auto-immunes et la modulation de la tolérance allogreffe. 4-6, 9 Ils sont rares dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires (ganglions de la rate et des ganglions lymphatiques ). Cependant, ils sont les principaux habitants du rein et de l'intestin épithélium normal 10-12. On sait très peu sur leur fonction 7 dans le rein à l'état stationnaire et dans des conditions pathologiques telles que l'insuffisance rénale aiguë (IRA) associée à rein transplfourmi.
En raison des rôles complexes de cellules immunitaires différentes dans la régulation des réponses immunitaires, y compris alloresponses, définissant le rôle de chaque joueur est critique dans la compréhension alloresponses et la conception de nouveaux produits thérapeutiques. Étant donné le nombre important de cellules T DN présents dans le rein dans des conditions physiologiques et pathologiques différentes, les cellules T DN sont susceptibles de jouer un rôle critique dans la régulation des réponses immunitaires et auto-immunes chez la souris et chez l'homme, et alloresponses chez les greffés. Accumuler si la preuve encore dispersés implique cellules T DN dans les deux fonctions pathogènes et immunosuppresseurs, mais il est mal compris pourquoi et comment ils présentent une fonction nuisible ou suppressive spécifique et comment l'environnement influe sur leurs décisions.
En raison de leur faible abondance dans le rein, l'amélioration des méthodes d'isolement sont nécessaires.
Il n'existe actuellement aucun protocole standard pour l'isolement de cellules de T DN Tes tissus non lymphoïdes. Notre protocole décrit un nouveau procédé pour l'isolement de cellules provenant du rein DN T; Cependant, le procédé peut également être utilisé pour divers tissus non lymphoïdes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya un intérêt croissant dans les cellules T DN car ils sont impliqués dans différentes pathologies telles que les troubles auto-immunes, le cancer, la tolérance du greffon, et les maladies primaires du rein, y compris insuffisance rénale aiguë (IRA), la glomérulonéphrite 8, 13. Par conséquent, il est nécessaire de mieux comprendre et caractériser les fonctions physiopathologiques de cellules T DN. Toutefois, actuellement, il ya un manque de compréhension de la fonction de ces cellules par rapp…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le NIH PBS (R21 AI095484). Nous remercions l'installation centrale de tétramère INSA de CD1d tétramère.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
Referências
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