FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング
Summary
その場代謝プロファイリングで用フェルスター共鳴エネルギー移動統合生物学的センサー（FIBS）を校正する方法の説明が提示されている。 FIBSは、非侵襲的に代謝モデルおよびバイオプロセス条件のハイスループットスクリーニングの開発を補助する代謝物の細胞内レベルを測定するために使用することができる。
Abstract
計算生物学の時代に、新しい高スループット実験系では、彼らは、予測の目的のために検証できるようにしたモデルを投入し、改良するために必要である。経時データを取得する場合に、理想的にはそのようなシステムは、破壊的サンプリングおよび分析を妨げる低容積、であろう。必要とされるのは、リアルタイムでかつ非侵襲的に必要な情報を報告することができ、その場で監視ツールである。興味深いオプションは、タンパク質ベースの細胞内濃度のレポーターとして、生体内の生物学的センサーでは 、蛍光の使用である。代謝産物の定量化における用途を発見したin vivoでのバイオセンサーの一つの特定のクラスは、リガンド結合ドメインによって接続された2つの蛍光タンパク質間のフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）に基づくものである。統合された生物学的センサー（FIBS）をFRETが構成的に細胞株内で生成され、それらは、速い応答時間およびそのスペクトルを有する茶細胞内の代謝物質の濃度に基づいて変更racteristics。本論文では、細胞内の代謝産物濃度の将来の定量化を可能にするために、構成的にグルコースおよびグルタミンFIBSを発現（CHO）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣を構築し、バッチ細胞培養におけるin vivoでの FIBSを較正するための方法が記載されている。フェドバッチCHO細胞培養からのデータはFIBSは細胞内濃度の結果として生じる変化を検出する各々の場合にできたことを示している。独立した酵素アッセイによって確認されるようにFIBS、予め作成した検量線からの蛍光シグナルを用いて、細胞内の濃度を正確に決定した。
Introduction
代謝産物監視は、プロセス開発、メディアおよび飼料設計、および代謝工学などのバイオプロセスにおける様々な用途を有する。種々の方法は、酵素1、化学2、又は3結合アッセイの使用を介して濃度測定に利用可能である。興味深いオプションは、タンパク質ベースのキー代謝物の細胞内濃度のレポーターとして、生体内の生物学的センサーでは 、蛍光の使用である。小型化は、実際に信号対雑音比の4,5を改善し、タンパク質ベースのセンサは、遺伝的に外因性試薬は代謝産物分析のために必要ではないという意味を符号化することができるように、超低容量アッセイにおいて、蛍光は便利なツールである。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）バイオセンサーは、リガンド結合ドメインによって接続された2つの蛍光タンパク質からなる。 FRETは、アクセプター蛍光分子LOCATへの光励起ドナーからのエネルギーの非放射伝達ですぐ近く（<100）で編。リガンドまたは結合開裂は、順番に、発光スペクトルの変化によって測定されたFRET効率の変化をもたらす、フルオロフォアの近接性の変化を誘導し、センサのコンフォメーション変化を引き起こす。 FRET統合生物学的センサー（FIBSは）構成的に細胞株内で生産され、それらのスペクトル特性は、細胞内の代謝物質の濃度に基づいて変化する。 FIBSは動的モデル6用の測定を行うために最適です迅速な応答時間を有する。以前のアプリケーションでは、7月9日 、単一および複数の10代謝物をモニターし、時空間分布11上のデータを提供することを含む。リガンド結合は、エネルギー移動およびリガンド結合がより密着します（ 図1）に2発蛍光をもたらしたApo-ミンを下げるフルオロフォアの近接性を崩壊させるのApo-マックス、：FIBSは2つの構成で作成することができます。
本研究では_contentは">、プロトコルはチャイニーズハムスター卵巣構成的代謝産物、グルコースまたはグルタミンFIBSを発現（CHO）細胞株を構築するために提示されている。方法論は、将来の定量を可能にするために、インビボでセンサの較正のために確立されている図2に示すように、細胞内代謝物濃度の測定を、これに基づいて、グルコースまたはグルタミンの細胞内濃度二つの栄養素をインプロセスで高濃度で添加したものに、流加培養CHO細胞培養物で決定することができる。結果それは非侵襲的で低コストであるため、独立した酵素アッセイによって確認されるようにFIBS、予め作成した検量線からの蛍光信号を用いて、細胞内濃度を正確に予測が可能であることを実証している。このメソッドは、現在の分析技術に対する実質的な利点を提供する共通とすることができるFIBSのリアルタイム信号を与えて、高速文化を通じてitored。Protocol
Representative Results
Discussion
FIBS焼入れおよび抽出方法に起因する不確実性を取り除く、この場合、増殖制限栄養素で、 生体内で 、キー分子のその場での定量に有効。知見はFIBS信号及びグルタミングルコースおよび0.3-2 mMの1-5 100mMの範囲で細胞内濃度との間に良好な相関関係があることを示唆している。バッチCHO細胞培養において、これらの濃度は、指数関数、固定、および早期衰退段階で遭遇する…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは親切親切にグルタミンを供給するためのグルコースのFRETプラスミド博士ウーヴェLudewig（ホーエンハイム大学）をご提供するために教授ウルフフロン（科学カーネギー研究所、スタンフォード大学）に感謝pUTKan植物発現ベクターに構築FRET。 ABはBBSRC目標と重点Studentshipsプログラムによって資金を供給される。 CKとKPの両方がバイオ医薬品の処理にRCUKフェローシップでサポートされています。 CKはまた彼らの財政支援のためにロンザ生物製剤に感謝したい。合成生物学とイノベーションのためのセンターは、寛大にEPSRCによってサポートされています。
Materials
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100X HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100X), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| (520NM BW 10NM) | |||
| 30022786 | |||
| (430NM BW 35NM) | |||
| 30022787 | |||
| (465NM BW 35NM) | |||
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer haemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
Referências
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