在现场研究巨噬细胞吞噬溶酶体生源
Abstract
吞噬细胞去除和消除其吞噬体入侵的微生物发挥先天免疫系统的重要作用。吞噬体成熟是复杂而严格监管的过程中，其中一个新兴的吞噬体通过与各种细胞器和车厢在细胞质中精心策划的互动经历了激烈的变革。这个过程，这是对吞噬细胞的吞噬体赋予其溶菌和杀菌性能的生理功能所必需的，高潮在融合吞噬体与溶酶体并且被认为是成熟为吞噬体的最后和关键的阶段吞噬溶酶体的生物合成。在这份报告中，我们描述了一个活细胞成像为基础的方法对溶酶体的动态过程的定性和定量分析，以吞噬小体内容交付，这是吞噬溶酶体生物发生的一个标志。这种方法使用IgG包被微珠作为一种模式phagocytosis和荧光标记的葡聚糖分子作为管腔溶酶体货物感，为了使用时间推移成像和激光扫描共聚焦显微镜遵循lysosmal含量的动态传递到吞噬体中实时直播巨噬细胞。在这里，我们详细描述了后台，准备步骤和一步一步的实验装置，以便在其他实验室容易和精确部署此方法。我们描述的方法很简单，功能强大，而且最重要的是，可以很容易地适应学习在不同的系统，并根据不同的实验设置，如利用各种吞噬细胞类型，功能丧失的实验，不同探头的吞噬体相互作用和成熟，以及吞噬颗粒。
Introduction
专业的吞噬细胞，包括巨噬细胞，发挥着关键的免疫系统。除了 作为防御的第一线中的先天免疫系统，它们也激活适应性免疫通过其信令和抗原中发挥关键作用呈递作用1-3。虽然专业吞噬细胞的功能是多方面的，吞噬体成熟是专业吞噬细胞4,5的杀菌和抗原处理功能的关键支柱。经受体介导的吞噬和吞噬靶，如细 菌的吸收，新生的吞噬体经过一个复杂的和精心策划的互动和交流与内吞网络的舱室和其他一些细胞器6的序列。所述化合物的性质交换与这些细胞的实体，以及调节和融合事件的定时决定了管腔吞噬体环境和phagosOMAL膜组成，因此7，成熟的吞噬体8的命运。
吞噬体成熟的生理意义是由各种细胞内的病原体采用从逃跑，逮捕或颠覆吞噬体成熟9多样化战略例证。大多数这些策略的直接或间接阻止吞噬体成熟过程的最后和关键的阶段：融合吞噬体与晚期胞内体/溶酶体区室，因而具有大量的水解酶和一个成熟的吞噬体7的抗菌因素，8,10。因此，这最后的和关键的一步分析，可以为我们提供强有力的指标有关的吞噬体的成熟的状态，如果自然的生理状态是正面或负面的根据正在使用的特定的实验设置的影响。
晚期内体/溶酶体S是通常被认为是内吞途径的终端室，通过各种存在的定义，并区别于早期的内吞车厢，特定阶段，标记分子。例如水解酶或膜成分，例如溶酶体相关膜蛋白（灯）等等11。终端内吞区室，此后简称为溶酶体，也可作为消化的最后阶段的主要位置处的吞噬/内吞途径12的端部。以这种方式，不易消化的探针可以通过内吞作用和巨胞饮作用从细胞外环境被加载，并通过内吞途径到溶酶体，在那里它下面定义的摄取和追逐的循环后累积13,14输送。荧光团共轭的探针，用于荧光显微镜，诸如有机聚合物的不易消化葡聚糖通常用作endocyticprobes 15-17。
<p class ="“jove_content”">在该方法中，我们描述了IgG包被的微珠的利用率作为吞噬货物通过分析交付溶酶体腔内容到吞噬体，调查吞噬体成熟。通过使用荧光标记的葡聚糖探针在活的骨髓来源的巨噬细胞（BMM）和延时视频成像与激光共聚焦扫描显微镜溶酶体的易检测的标记，我们按照货物配送的动态过程分成吞噬体与高时间分辨率。然后，我们将介绍如何收集时间推移成像数据可以用开源及可自由查看的图像分析软件，斐济（或ImageJ的）进行评估，统计分析采用Microsoft Excel和使用GraphPad Prism软件14,18呈现。按照我们的方法的描述，类似的实验，可以使用修改后的设置和因素，探讨其在吞噬体成熟的影响进行设计;几乎任何OT她的类型附着的初级或细胞系吞噬细胞，功能实验包括遗传损失基因敲除和敲除体，突变体或融合蛋白，吞噬靶，微珠涂覆化合物，核内体/溶酶体探针和因素，例如一个表达细胞因子，化学抑制剂，或siRNA等等都可以应用这种方法的基本方法的所有变量。
我们定义该方法的如下目标与基本要求：
- 目标的方法：启用直接，定量和定性的观察吞噬体成熟和分析生活中的吞噬细胞高时间分辨率。
- 吞噬货物：一个适当包衣微粒或生物靶标。在这里，我们用IgG包被通过的Fc-γ受体介导的吞噬作用容易内化3微米的球形聚苯乙烯微粒。另外，任何微生物或涂层麦克风可用于roparticle为其中吞噬受体是存在于细胞中。
- 吞噬细胞：表达适当的吞噬受体粘附吞噬细胞。在这里，我们用鼠标主要桥梁养护管理的丰富表达的Fc-γ受体。可替换地，树突状细胞（DC），单核细胞或吞噬上皮细胞或其遗传突变或敲除变体也可以使用。
- 溶酶体货物：一个荧光标记的溶酶体探针。这里，德克萨斯红偶联70000千道尔顿的葡聚糖（Dex70kD）用作溶酶体的腔货物。可替换地，一个细胞区室或细胞器，或用于吞噬体性能如酸度或降解能力的适当的探针的任何荧光检测的标志物，可用于研究吞噬体成熟的进展。
- 影响因素：例如，信号分子，化合物，基因敲下来，或突变蛋白可能的瞬时表达。在这里，我们已经锻件1使用这样的一个因素为简单起见，但对于最近的一个例子与突变体蛋白的表达和敲低影响因素请参阅Kasmapour 等人 18，可以影响细胞吞噬吞噬体或情况和迁移率和/不限因子或与吞噬体成熟交互的车厢可能被使用。
Protocol
在这个协议的动物保健和所有程序遵循的制度和国家指导方针。 准备是由“Π型”预先指示的准备工作。 1。桥梁养护管理的制备颈椎脱位进行小鼠的扑杀。 从组织中取出股骨和胫骨，免费骨骼和修剪两端的骨髓的可访问性。 保持骨骼在冰冷的PBS或冰冷的DMEM培养基（补充有100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，置于冰上，直到?…
Representative Results
正确的制剂的细胞和珠子成像是至关重要的。 图1显示了播种，探针装载和在该方法中初始成像步骤，根据我们对桥梁养护管理优化的协议的轮廓。它是必不可少的，因此，该协议参数进行测试和优化取决于细胞和探针要使用的类型。 另外的抗体包被的珠的预加载的细胞后，重要的是，视场被选择的方式，以提供最大数目的潜在摄取事件的最大数量的细胞成为可?…
Discussion
在下面的部分我们将讨论所提出的方法及其局限性的关键步骤。此外，我们将连接一些与他们的解决方案中常见的问题，提出可能的修改，并考虑我们的方法的优点，以及合适的配套方法，这种方法。
的珠子，包括IgG的胎圈表面上的耦合的制备方法，是至关重要的，应该避免使用unfresh制剂。在增加的，它是同样重要的是葡聚糖是从冷冻股票（稀释和消毒）新鲜每次实验前准?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢吞噬体生物学实验室手稿的批判性阅读的成员。这项工作是由亥姆霍兹青年研究者补助（倡议和亥姆霍兹联合会的网络基金） 和优先方案，德国研究理事会（德意志研究联合会，DFG）的SPP1580资助。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
Referências
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
Citar este artigo
Bronietzki, M., Kasmapour, B., Gutierrez, M. G. Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages. J. Vis. Exp. (85), e51201, doi:10.3791/51201 (2014).