Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen
Abstract
Fresszellen spielen eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunsystems durch Entfernen und Beseitigen eindringende Mikroorganismen in ihren Phagosomen. Phagosomenreifung sind die komplexen und stark regulierten Prozess, bei dem eine im Entstehen begriffene phagosome erfährt drastische Transformation durch gut organisierte Interaktion mit verschiedenen zellulären Organellen und Fächer im Zytoplasma. Dieser Prozess, der essentiell für die physiologische Funktion der Fresszellen durch auszustatten Phagosomen mit ihren lytischen und bakteriziden Eigenschaften ist, gipfelt in Fusion von Phagosomen mit Lysosomen und Biogenese der Phagolysosomen, die als die letzte und entscheidende Phase der Reifung für Phagosomen sein wird. In diesem Bericht beschreiben wir eine Live-Cell-Imaging-basierte Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse des dynamischen Prozess der Lysosomen, die Lieferung, die ein Markenzeichen der Phagolysosom Biogenese ist Phagosom. Dieser Ansatz verwendet IgG-beschichteten Mikroperlen als Modell für phagocytose und fluorophorkonjugierten Dextranmolekülen als Lumen lysosomalen Fracht-Sonde, um die dynamische Bereitstellung von lysosmal Inhalte an die Phagosomen in Echtzeit im Live-Makrophagen folgen mit Zeitraffer-Imaging und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie. Hier beschreiben wir detailliert den Hintergrund, die Vorbereitungsschritte und den Schritt-für-Schritt-Versuchsaufbau zur einfachen und präzisen Einsatz dieser Methode in anderen Labors zu ermöglichen. Unsere beschriebene Verfahren ist einfach, robust und vor allem leicht angepasst phagosomalen Wechselwirkungen und Reifung in verschiedenen Systemen und unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, wie die Verwendung von verschiedenen Arten Phagozyten, Verlust-Funktion Experimenten verschiedene Sonden zu untersuchen, und phagozytierenden Partikel.
Introduction
Professionelle Phagozyten, einschließlich Makrophagen, spielen im Immunsystem eine kritische. Zusätzlich dazu, dass die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems, sie spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des adaptiven Immunität durch ihre Signal-und Antigen-präsentierenden Rolle 03.01. Während die Funktion von professionellen Phagozyten ist vielfältig ist Phagosomenreifung die kritische Rückgrat der bakteriziden und Antigen-Verarbeitungsfunktion der professionellen Phagozyten 4,5. Bei der Rezeptor-vermittelten Phagozytose und die Aufnahme einer Phagozyten Ziel, wie Bakterien, geht die entstehenden Phagosom über ein komplexes und gut organisierten Ablauf der Interaktion und Austausch mit Fächern des endozytischen Netzwerk und mehreren anderen Zellorganellen 6. Die Art der Verbindungen ausgetauscht mit dieser zellulären Unternehmen als auch die Regulierung und der Zeitpunkt der Fusionsereignisse bestimmt die Lumen phagosomalen Milieu und die phagosomal Membranzusammensetzung und damit 7, das Schicksal der Reifung phagosome 8.
Die physiologische Relevanz der Phagosomenreifung wird durch die durch verschiedene intrazelluläre Erreger eingesetzt zu entkommen, zu verhaften oder zu untergraben Phagosomenreifung 9 verschiedenen Strategien veranschaulicht. Die meisten dieser Strategien, die direkt oder indirekt verhindern, dass die letzte und entscheidende Phase der Phagosomenreifung Prozess: die Verschmelzung von Phagosom mit spät endosomale / lysosomale Kompartimente, die sie mit dem Großteil der hydrolytischen Enzymen und antibakteriellen Faktoren einer reifen phagosome 7 verleiht , 8,10. Die Analyse dieser letzte und entscheidende Schritt daher können Sie uns starke Indikatoren über den Zustand der Reifung der Phagosomen bieten und wenn sein wird das natürliche physiologische Zustand positiv oder negativ unter den jeweiligen experimentellen Einstellungen, die genutzt sind betroffen.
Die späte endosomale / lysosomale Kompartiments werden im Allgemeinen betrachtet, um die Klemmenräume der endocytischen, definieren und von den frühen endozytotischen Kompartimente durch die Anwesenheit von verschiedenen, spezifischen Stadium, Markermoleküle sein. Zum Beispiel hydrolytische Enzyme oder Membrankomponenten wie lysosomale Membranproteinen assoziiert (Lampen) unter anderem 11. Das Terminal endozytischen-Fächer fortan einfach als Lysosomen-auch als Hauptstandort für die letzten Stadien der Verdauung am Ende der phagozytären / endocytischen 12 dienen bezeichnet. Auf diese Weise können unverdauliche Sonden durch Endozytose und Makropinozytose aus dem extrazellulären Milieu geladen und durch den endocytischen zu den Lysosomen, wo es sich ansammelt 13,14 nach nach einem bestimmten Zyklus der Aufnahme und Chase transportiert werden. Fluorophor-konjugierten Sonden zur Fluoreszenzmikroskopie wie organischen unverdaulichen Polymer Dextran werden üblicherweise als endocyticprobes 15-17.
<p class = "jove_content"> Bei diesem Verfahren beschreiben wir die Verwendung von IgG-beschichteten Mikrokügelchen als phagozytischen Ladung Phagosomenreifung durch Analysieren der Lieferung von lysosomalen luminalen Inhalte Phagosomen untersuchen. Durch die Verwendung eines fluorophorkonjugierten Dextran Sonde als leicht nachweisbaren Marker von Lysosomen in Live-Knochenmark-Makrophagen (BMM) und Zeitraffer-Video-Imaging mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, folgen wir dem dynamischen Prozess der Zustellung der Ladung in Phagosomen mit hoher zeitliche Auflösung. Wir beschreiben dann, wie die gesammelten Zeitraffer-Bilddaten können mit dem Open-Source und frei verfügbaren Bildanalyse-Software, Fidschi (oder ImageJ) ausgewertet werden, mit Microsoft Excel statistisch analysiert und präsentiert mit GraphPad Prism Software 14,18.Nach der Beschreibung unserer Methode können analoge Versuche mit geänderten Einstellungen und Faktoren, deren Einfluss auf Phagosomenreifung untersuchen gestaltet werden; praktisch jede otihr Typ von adhärenten primären oder Zelllinie Fresszellen, genetische Funktionsverlust Experimente mit Gen-Knock-out und Knock-down, Mutanten oder Expression von Fusionsproteinen, phagocytic-Ziele, Mikrokügelchen Beschichtungsmassen, endosomalen / lysosomalen Sonden und Faktoren wie eine Zytokine, chemische Inhibitoren oder siRNA unter anderem alle Variablen, die auf den grundlegenden Ansatz dieser Methode angewendet werden kann.
Wir definieren das Ziel und die grundlegenden Anforderungen dieser Methode wie folgt:
- Ziel der Methode: direkte, quantitative und qualitative Beobachtung und Analyse der Phagosomenreifung mit hoher zeitlicher Auflösung in lebenden Fresszellen zu aktivieren.
- Phagozytische Ladung: Ein entsprechend beschichteten Mikropartikel oder biologische Ziel. Hier verwenden wir IgG-beschichteten 3 um sphärische Polystyrol-Mikropartikel, die leicht über den Fc-γ-Rezeptor-vermittelten Phagozytose internalisiert werden. Alternativ jeder Mikroorganismus oder beschichtet microparticle für die eine phagozytische Rezeptor vorhanden ist an den Zellen verwendet werden.
- Phagozyten: Adherent phagozytierenden Zellen, die die entsprechenden Rezeptoren phagocytic. Hier verwenden wir primären Maus BMM, die reichlich die Fc-γ-Rezeptoren exprimieren. Alternativ können dendritische Zellen (DC), Monozyten oder phagozytischen Epithelzellen oder ihre genetische Mutanten oder Knock-out-Varianten verwendet werden.
- Lysosomal Ladung: Ein fluoreszenzmarkierte Sonde lysosomalen. Hier wird Texas Red-konjugiert 70.000 Kilodalton Dextran (Dex70kD) als Lumen Ladung von den Lysosomen verwendet. Alternativ kann jede Fluoreszenz nachweisbare Marker ein zelluläres Kompartiment oder Organelle oder einer geeigneten Sonde für phagosomalen Eigenschaften wie Säure-oder Abbauleistung, verwendet werden, um das Fortschreiten der Phagosomenreifung untersuchen.
- Einflussfaktoren: Zum Beispiel, Signalmoleküle, chemische Verbindungen, Gen-knock-down oder transiente Expression des mutierten Proteine konnte. Hier haben wir Förgein die Nutzung eines solchen Faktor für die der Einfachheit halber, aber für ein aktuelles Beispiel mit mutierten Proteinexpression und knock-down Einflussfaktoren finden Sie in 18 Kasmapour et al. Jeder Faktor, der Phagozytose oder die Umstände und die Mobilität von Phagosomen beeinflussen können und / oder die Fächer, die mit reif Phagosomen interagieren könnten verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im folgenden Abschnitt werden wir wichtige Schritte des vorgestellten Verfahrens und seine Grenzen zu diskutieren. Außerdem werden wir einige der häufigsten Probleme, mit ihren Lösungen zu verbinden, mögliche Änderungen einzuführen und betrachten Vorteile unserer Methode sowie geeignete komplementäre Methoden für diesen Ansatz.
Die Herstellung der Kügelchen, einschließlich der Kopplung von IgG an die Oberfläche der Kügelchen, ist entscheidend und die Verwendung unfresh Zubereitun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder der Phagosomen Biologie-Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wird von einem Helmholtz-Young Investigator Grant (Impuls-und Vernetzungsfonds der Helmholtz-Gemeinschaft) und eine Schwerpunktprogramm SPP1580 Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
Referências
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
- Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
- Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
- Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
- de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
- Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
- Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
- Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
- Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
- Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
- Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
- Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
- Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
- Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
- Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
- Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
- Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
- Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
- Aziz, M., Yang, W. -. L., Wang, P., Coliganet, J. E. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. 14, (2013).
- Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
- Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
- Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -. M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).
