लाइव मैक्रोफेज में Phagolysosome biogenesis का अध्ययन
Abstract
Phagocytic कोशिकाओं को हटाने और उनके phagosomes में हमलावर सूक्ष्मजीवों को नष्ट करने से सहज प्रतिरक्षा प्रणाली में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. Phagosome परिपक्वता एक नवजात फेगोसोम कोशिका द्रव्य में विभिन्न सेलुलर organelles और डिब्बों के साथ अच्छी तरह से करवाया बातचीत के माध्यम से कठोर परिवर्तन की प्रक्रिया होती है जिसके दौरान जटिल और कसकर विनियमित प्रक्रिया है. उनके अपघट्य और जीवाणुनाशक गुण के साथ phagosomes endowing द्वारा phagocytic कोशिकाओं के शारीरिक समारोह के लिए आवश्यक है, जो इस प्रक्रिया में, लाइसोसोम और phagosomes के लिए परिपक्वता के अंतिम और महत्वपूर्ण चरण माना जाता है जो phagolysosomes की जीवजनन साथ phagosomes के विलय में खत्म. इस रिपोर्ट में, हम phagolysosome जीवजनन की एक बानगी है जो सामग्री वितरण, phagosome को लाइसोसोम के गतिशील प्रक्रिया के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक जीवित कोशिका इमेजिंग आधारित विधि का वर्णन. यह दृष्टिकोण phagocy के लिए एक मॉडल के रूप में आईजीजी में लिपटे microbeads का उपयोग करता हैएक luminal lysosomal कार्गो जांच के रूप में tosis और fluorophore संयुग्मित dextran अणुओं, समय चूक इमेजिंग और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का उपयोग लाइव मैक्रोफेज में वास्तविक समय में phagosomes को lysosmal सामग्री के गतिशील वितरण का पालन करने के क्रम में. यहाँ हम विस्तार से पृष्ठभूमि, तैयारी कदम और अन्य प्रयोगशालाओं में इस विधि का आसान और सटीक तैनाती सक्षम करने के लिए कदम दर कदम प्रयोगात्मक सेटअप का वर्णन. हमारे वर्णित विधि सरल, मजबूत, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह आसानी से विभिन्न प्रणालियों में और इस तरह के विभिन्न phagocytic कोशिकाओं प्रकार, हानि के समारोह प्रयोगों, अलग जांच के उपयोग के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग के तहत phagosomal बातचीत और परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और phagocytic कणों.
Introduction
मैक्रोफेज सहित व्यावसायिक फ़ैगोसाइट, प्रतिरक्षा प्रणाली में एक महत्वपूर्ण खेलते हैं. सहज प्रतिरक्षा प्रणाली में रक्षा की पहली पंक्ति होने के अलावा, वे भी भूमिका 1-3 पेश उनके संकेतन और प्रतिजन के माध्यम से प्रतिरक्षा अनुकूली की सक्रियता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. पेशेवर फ़ैगोसाइट के समारोह में बहुमुखी है, phagosome परिपक्वता पेशेवर फ़ैगोसाइट 4,5 की जीवाणुनाशक और प्रतिजन प्रसंस्करण समारोह के महत्वपूर्ण रीढ़ है. रिसेप्टर मध्यस्थता घिराव और बैक्टीरिया जैसे एक phagocytic लक्ष्य, के तेज होने पर नवजात फेगोसोम बातचीत और endocytic नेटवर्क के डिब्बों और कई अन्य सेलुलर organelles 6 के साथ आदान प्रदान का एक जटिल और अच्छी तरह से करवाया अनुक्रम के माध्यम से चला जाता है. यौगिकों की प्रकृति इन सेलुलर संस्थाओं के साथ ही विनियमन के साथ विमर्श किया और फ्यूजन घटनाओं के समय luminal phagosomal परिवेश और phagos निर्धारित करता हैOmal झिल्ली संरचना और, इस प्रकार 7, परिपक्व फेगोसोम 8 के भाग्य.
फेगोसोम परिपक्वता की शारीरिक प्रासंगिकता, से बचने की गिरफ्तारी या फेगोसोम परिपक्वता 9 नाश के लिए विभिन्न intracellular रोगज़नक़ों द्वारा नियोजित विविध रणनीतियों द्वारा उदाहरण है. Hydrolytic एंजाइमों और एक परिपक्व फेगोसोम 7 के विरोधी बैक्टीरियल कारकों के थोक के साथ उन्हें endows जो देर endosomal / lysosomal डिब्बों के साथ फेगोसोम का फ्यूजन,: इन रणनीतियों में से अधिकांश सीधे या परोक्ष रूप से phagosome परिपक्वता की प्रक्रिया के अंतिम और महत्वपूर्ण चरण को रोकने के , 8,10. प्राकृतिक शारीरिक स्थिति का उपयोग किया जा रहा है कि विशेष रूप से प्रयोगात्मक सेटिंग के तहत प्रभावित सकारात्मक या नकारात्मक किया जा रहा है इस अंतिम और महत्वपूर्ण कदम का विश्लेषण इसलिए phagosomes की परिपक्वता की स्थिति के बारे में मजबूत संकेतक के साथ हमें प्रदान कर सकते हैं.
देर endosomal / lysosomal कम्पार्टमेंटएस आम तौर पर विभिन्न की मौजूदगी से जल्दी endocytic डिब्बों से परिभाषित और प्रतिष्ठित endocytic मार्ग के टर्मिनल डिब्बों, विशिष्ट, मार्कर अणुओं चरण होने के लिए माना जाता है. उदाहरण के लिए इस तरह दूसरों के 11 के बीच Lysosomal जुड़े झिल्ली प्रोटीन (दीपक) के रूप में hydrolytic एंजाइमों या झिल्ली घटकों के लिए. टर्मिनल endocytic डिब्बों-आगे से लाइसोसोम भी phagocytic / endocytic मार्ग 12 के अंत में पाचन के अंतिम चरण के लिए मुख्य स्थान के रूप में सेवा के लिए बस के रूप में भेजा. इस तरह, nondigestible जांच बाह्य परिवेश से endocytosis और macropinocytosis के माध्यम से लोड किया जा सकता है और यह तेज और चेस का एक परिभाषित चक्र के बाद के बाद 13,14 जम जाता है जहां लाइसोसोम को endocytic मार्ग, के माध्यम से पहुँचाया. 15-17 endocyticprobes के रूप में इस तरह के कार्बनिक nondigestible बहुलक dextran के रूप में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए fluorophore संयुग्मित जांच आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं.
<p clasइस विधि में एस = "jove_content">, हम phagosomes को लाइसोसोमल luminal सामग्री के वितरण का विश्लेषण करके फेगोसोम परिपक्वता की जांच के लिए phagocytic कार्गो के रूप में आईजीजी में लिपटे microbeads के उपयोग का वर्णन. लाइव अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMM) और एक confocal लेजर स्कैनिंग खुर्दबीन के साथ समय व्यतीत हो वीडियो इमेजिंग में लाइसोसोम की एक आसानी से detectable मार्कर के रूप में एक fluorophore संयुग्मित dextran जांच का उपयोग करके, हम उच्च साथ phagosomes में माल डिलीवरी के गतिशील प्रक्रिया का पालन करें अस्थायी समाधान. हम तो सांख्यिकीय माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल का उपयोग विश्लेषण और GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर 14,18 उपयोग कर प्रस्तुत किया, एकत्र समय चूक इमेजिंग डेटा खुला स्रोत और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, फिजी (या ImageJ) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता का वर्णन कैसे.हमारे विधि का वर्णन के बाद, अनुरूप प्रयोगों फेगोसोम परिपक्वता पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित सेटिंग्स और कारकों का उपयोग कर बनाया जा सकता है, वास्तव में किसी भी ओ.टी.पक्षपाती प्राथमिक या सेल लाइन phagocytic कोशिकाओं की उसके प्रकार, सहित समारोह प्रयोगों की आनुवंशिक नुकसान जीन बाहर दस्तक और तोड़े नीचे, म्यूटेंट या संलयन प्रोटीन, phagocytic लक्ष्य, microbead कोटिंग यौगिकों, endosomal / lysosomal जांच और कारकों जैसे एक की अभिव्यक्ति दूसरों के बीच में साइटोकिन्स, रासायनिक inhibitors, या siRNA इस विधि के बुनियादी दृष्टिकोण को लागू किया जा सकता है कि सभी चर रहे हैं.
हम के रूप में इस पद्धति का लक्ष्य और बुनियादी आवश्यकताओं को परिभाषित:
- विधि का लक्ष्य: phagocytic जीवित कोशिकाओं में उच्च अस्थायी समाधान के साथ फेगोसोम परिपक्वता की, प्रत्यक्ष मात्रात्मक और गुणात्मक अवलोकन और विश्लेषण कर सकें.
- Phagocytic कार्गो: एक उचित लेपित microparticle या जैविक लक्ष्य. यहाँ हम आसानी एफसी-γ रिसेप्टर मध्यस्थता phagocytosis के माध्यम से भली भाँति रहे हैं कि 3 माइक्रोन गोलाकार polystyrene microparticles आईजीजी में लिपटे उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, किसी भी सूक्ष्मजीव या लेपित micएक phagocytic रिसेप्टर कोशिकाओं पर मौजूद है जिसके लिए roparticle इस्तेमाल किया जा सकता है.
- Phagocytic कोशिकाओं: उचित phagocytic रिसेप्टर्स व्यक्त पक्षपाती phagocytic कोशिकाओं. यहाँ हम बहुतायत एफसी-γ रिसेप्टर्स व्यक्त जो माउस प्राथमिक BMMs का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी), monocytes या phagocytic उपकला कोशिकाओं या उनके आनुवंशिक म्यूटेंट या नाक आउट वेरिएंट इस्तेमाल किया जा सकता है.
- Lysosomal कार्गो: एक fluorescently लेबल lysosomal जांच. इधर, टेक्सास लाल संयुग्मित 70,000 kiloDaltons dextran (Dex70kD) लाइसोसोम की luminal माल के रूप में प्रयोग किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, इस तरह की अम्लता या degradative क्षमता के रूप में phagosomal संपत्तियों के लिए एक सेलुलर डिब्बे या organelle, या एक उचित जांच के किसी भी fluorescently detectable मार्कर, phagosome परिपक्वता की प्रगति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- उदाहरण के लिए, अणु, रासायनिक यौगिकों, जीन दस्तक नीचे सकता है, या उत्परिवर्ती प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति संकेत: कारकों को प्रभावित. यहाँ, हम FORG हैसादगी के लिए इस तरह के एक कारक के एक प्रयोग करें, लेकिन उत्परिवर्ती प्रोटीन अभिव्यक्ति और Kasmapour एट अल. 18 phagosomes के phagocytosis या परिस्थितियों और गतिशीलता को प्रभावित और / कर सकते हैं कि किसी भी पहलू देखने के लिए कृपया नीचे दस्तक को प्रभावित करने वाले कारकों के साथ हाल ही में एक उदाहरण के लिए या परिपक्व phagosomes के साथ बातचीत कि डिब्बों के संभावित इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
निम्न भाग में हम प्रस्तुत विधि और उसकी सीमाओं का महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा करेंगे. इसके अलावा, हम उनके समाधान के साथ आम समस्याओं में से कुछ कनेक्ट संभव संशोधनों को लागू करने और हमारे विधि के फायदे के साथ ह…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए phagosome जीवविज्ञान प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. यह काम एक Helmholtz युवा अन्वेषक अनुदान (पहल और Helmholtz एसोसिएशन की नेटवर्किंग फंड) और एक प्राथमिकता कार्यक्रम जर्मन अनुसंधान परिषद (ड्यूश Forschungsgemeinschaft, DFG) के SPP1580 अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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