라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구
Abstract
식세포는 삭제 및 된 phagosomes에 침입하는 미생물을 제거함으로써 선천성 면역 시스템에서 중요한 역할을한다. 성숙의 phagosome는 초기의 phagosome는 세포질에있는 다양한 세포 소기관 및 구획이 잘 조율 된 상호 작용을 통해 급격한 변화를 겪게되는 동안의 복잡하고 단단하게 통제 된 과정입니다. 자신의 세포 용해 및 살균 속성으로 된 phagosomes를 부여하는에 의한 식세포의 생리 기능을 위해 필수적이며이 과정은, 리소좀과 phagosomes를위한 성숙의 마지막 중요한 단계로 간주됩니다 phagolysosomes의 생합성로 된 phagosomes의 융합에 절정에 이른다. 이 보고서에서, 우리는 phagolysosome의 생합성의 특징이다 콘텐츠 전달을의 phagosome하는 리소좀의 역동적 인 과정의 정성 및 정량 분석을 위해 라이브 셀 이미징 기반 방법을 설명합니다. 이 접근법은 phagocy 모델로의 IgG 코팅 된 마이크로 비드를 사용내강 리소좀화물 프로브로 tosis 및 형광 – 복합 덱스 트란 분자, 시간 경과 이미징 및 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 라이브 대식 세포에서 실시간으로 된 phagosomes에 lysosmal 콘텐츠의 동적 전달을 수행하기 위해. 여기에 우리가 자세히 배경, 준비 단계 및 기타 실험실에서이 방법의 쉽고 정확한 배치를 가능하게하는 단계별 실험 설정에 대해 설명합니다. 우리의 기술 방법은, 간단한 강력한, 가장 중요한 것은, 쉽게 다른 시스템과 같은 각종 식세포 종류, 기능 상실 실험 상이한 프로브의 사용과 같은 여러 가지 실험 설정에서 phagosomal 상호 작용 및 성숙을 연구하기 위해 적응 될 수 있으며, 식세포 입자.
Introduction
대 식세포 등의 전문 식세포는 면역 시스템에서 중요한 재생할 수 있습니다. 선천성 면역 시스템 방어의 첫 번째 라인 인 이외에, 그들은 또한 역할 1-3 제시 그들의 시그널링 및 항원을 통하여 적응 면역의 활성화에 중요한 역할을한다. 전문 식세포의 기능이 다방면 동안, 성숙의 phagosome는 전문 식세포 4,5의 살균 및 항원 처리 기능의 중요한 골격이다. 수용체 매개 말림 및 박테리아와 같은 식세포 대상의 이해에 따라, 초기의 phagosome는 상호 작용과 세포 내 이입 네트워크의 구획 및 여러 다른 세포 소기관 6과의 교류의 복잡하고 잘 조율 된 순서를 통해 간다. 화합물의 성질은 이러한 셀룰러 엔티티뿐만 아니라 규제와 교환 및 융합 이벤트의 타이밍은 내강 phagosomal의 환경 및 phagos을 결정OMAL 막 조성과, 따라서 7, 성숙의 phagosome 8의 운명.
성숙의 phagosome의 생리 학적 관련성은 탈출 체포 또는 성숙의 phagosome 9를 파괴하기 위해 다양한 세포 내 병원균에 의해 사용되는 다양한 전략을들 수있다. 가수 분해 효소 및 성숙의 phagosome 7 안티 박테리아 요소 벌크 그들을 부여한다 늦은 엔도 솜 / 리소좀 구획의 phagosome의 융합, 이러한 전략의 대부분은 직접 또는 간접적으로 성숙의 phagosome 프로세스의 최종적이고 중요한 단계를 방지 , 8,10. 자연의 생리 학적 상태가 활용되고있는 특정 실험 설정에서 영향을 긍정적으로 또는 부정적으로되는 경우이 마지막 중요한 단계의 분석은 따라서 phagosomes를 성숙의 상태에 대해 강한 지표를 저희에게 제공 할 수 있습니다.
늦은 엔도 좀 / 리소좀 함설정 해제는 일반적으로 각종의 존재에 의해 초기 세포 내 이입 구획에서 정의한 고유 세포 내 이입 경로의 말단 구획, 특정 마커 분자를 무대로 간주된다. 예를 같은 사람 11 중 리소좀 관련 막 단백질 (램프)로 가수 분해 효소 또는 막 구성 요소에 대한. 단말 내 이입이 구획-금후 리소좀는 또한-식세포 / 이입 통로 (12)의 단부에 소화의 최종 단계를 위해 주요 위치 역할을 간단히 언급. 이러한 방식으로, 난소 화성 프로브는 세포 외 환경에서의 엔도 시토 시스와 macropinocytosis 통해로드 될 수 있고, 그것은 흡수 및 체이스의 정의 사이클에 따라도 13, 14를 축적 리소좀으로 세포 내 이입 경로를 통해 반송. 15-17 endocyticprobes 등 유기 난소 화성 고분자 덱스 트란 형광 현미경 형광 – 복합 프로브는 일반적으로 사용됩니다.
<p clas이 방법의 = "jove_content">, 우리는 된 phagosomes에 리소좀 내강 내용의 전달을 분석하여 성숙의 phagosome을 조사하기 식세포화물로 IgG의 코팅 마이크로 비즈의 활용에 대해 설명합니다. 라이브 골수 유래 대 식세포 (BMM) 및 공 초점 레이저 주사 현미경 시간 경과 비디오 영상에서 리소좀의 즉시 검출 마커로 형광 – 복합 덱스 트란 프로브를 사용하여, 우리는 최고를 가진 된 phagosomes에화물 배달의 동적 프로세스를 따라야 시간 해상도. 우리는 통계적으로 Microsoft Excel을 사용하여 분석 및 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 (14, 18)를 사용하여 제시 수집 시간 경과 영상 데이터는 오픈 소스와 무료로 사용할 이미지 분석 소프트웨어, 피지 (또는 ImageJ에)를 사용하여 평가 될 수있는 방법에 대해 설명합니다.우리의 방법에 대한 설명에 이어, 유사한 실험의 phagosome 성숙에 미치는 영향을 조사하기 위해 수정 된 설정 요인을 사용하여 설계 될 수 있으며, 거의 모든 OT부착 차 또는 세포 라인 포식 세포의 그녀의 유형을 포함하여 기능 실험의 유전 손실 유전자 아웃을 노크 노크 다운, 돌연변이 또는 융합 단백질, 식세포 – 대상, 마이크로 비드 코팅 화합물, 엔도 좀 / 리소좀 프로브 및 요인 등의 표현 그 중에서도 사이토킨, 화학 억제제 또는 siRNA의이 방법의 기본적인 접근 방식에 적용될 수있는 모든 변수이다.
우리는 다음과 같이이 방법의 목표와 기본 요구 사항을 정의 :
- 방법의 목표 : 식세포의 살아있는 세포에서 높은 시간 해상도와 성숙의 phagosome의 직접 양적 및 질적 관찰과 분석을 가능하게하는.
- 식세포화물 : 적절하게 코팅 된 미세 입자 또는 생물학적 대상입니다. 여기에서 우리는 쉽게 구단-γ 수용체 매개 식균 작용을 통해 내장되어 3 μm의 구형 폴리스티렌 미립자 IgG의 코팅 사용합니다. 또한, 모든 미생물 또는 코팅 된 마이크식세포 수용체는 세포에 존재하는 roparticle가 사용될 수있다.
- 식세포 : 해당 식세포 수용체를 표현 자기편 식세포. 여기에서 우리는 풍부 구단-γ 수용체를 표현 마우스 기본의 BMMs를 사용합니다. 또한, 수지상 세포 (DC), 단핵구 또는 식세포 상피 세포 또는 유전자 돌연변이 또는 녹아웃 변형이 사용될 수있다.
- 리소좀화물 : 찬란 리소좀 프로브. 여기에, 텍사스 레드 – 복합 70,000 킬로 달톤의 덱스 트란 (Dex70kD)는 리소좀의 내강화물로 사용됩니다. 대안 적으로, 산도있는 분해 능력으로 phagosomal 속성에 대한 세포 구획 또는 세포 기관, 또는 적절한 프로브의 형광 검출 마커, 성숙의 phagosome의 진행을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
- , 예를 들어 분자, 화합물, 유전자 노크 다운, 또는 할 수 돌연변이 단백질의 일시적 발현 신호 : 요인에 영향을 미치는. 여기, 우리는 FORG있다간단히하기 위해 이러한 요소 중 하나를 사용하지만, 돌연변이 단백질 발현 및 Kasmapour 등. 18 된 phagosomes의 식균 작용 또는 상황과 이동성에 영향을 / 수있는 모든 요소를 참조하십시오 노크 다운에 영향을 미치는 요인과 최근의 예를 들면, 또는 성숙 된 phagosomes와 상호 작용하는 구획은 잠재적으로 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음 섹션에서 우리는 제시된 방법과 그 한계의 중요한 단계를 설명합니다. 또한, 우리는 그들의 솔루션과 일반적인 문제 중 일부를 연결 가능한 수정 사항을 소개하고 우리의 방법의 장점뿐만 아니라이 방법에 적합한 보완적인 방법을 고려할 것입니다.
비드 표면의 IgG의 결합을 포함한 비드의 제조는, 결정적이고 unfresh 제제의 사용은 피해야한다. 그것에 추가, 그것은 덱스…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 중요한 읽기의 phagosome 생물학 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 헬름홀츠 젊은 탐정 그랜트 (이니셔티브와 헬름홀츠 협회의 네트워킹 기금) 및 우선 순위 프로그램의 독일 연구위원회 (도이치 Forschungsgemeinschaft, DFG)의 SPP1580 교부금에 의해 지원된다.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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