Apresentamos a síntese de um hidrogel mediada-intein desdobramento da proteína. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. A mistura dos dois copolímeros de proteínas desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de poliptido que se auto-monta para um hidrogel. Este hidrogel é altamente pH e temperatura estáveis, compatíveis com solventes orgânicos, e facilmente incorpora proteínas globulares funcionais.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apresentamos a síntese de uma proteína de hidrogel altamente estável mediada por um catalisado-intein dividida proteína reacção de splicing trans. Os blocos de construção da presente hidrogel são dois copolímeros em bloco de proteínas, cada uma contendo uma subunidade de uma proteína trimérica, que serve como um agente de ligação cruzada e uma metade de um intein dividida. Uma bobina aleatório altamente hidrofílico é inserida em um dos copolímeros em bloco de retenção de água. A mistura dos dois copolímeros em bloco a proteína desencadeia uma reacção de splicing trans intein, obtendo-se uma unidade de polipeptídeo com agentes de reticulação em ambas as extremidades que rapidamente auto-monta em um hidrogel. Este hidrogel é muito estável tanto em condições ácidas e básicas, a temperaturas até 50 ° C, e em solventes orgânicos. O hidrogel rapidamente reformas após ruptura induzida por cisalhamento. Incorporação de um "encaixe estação peptídeo" para o bloco de construção de hidrogel permite incorporação conveniente de "proteína de ancoragem", marcado proteínas-alvo.O hidrogel é compatível com o meio de crescimento de cultura de tecidos, suporta a difusão de moléculas de 20 kDa, e permite a imobilização de proteínas globulares bioactivos. A aplicação do hidrogel proteína intein-mediada como um biocatalisador compatível com solvente orgânico foi demonstrada por encapsular a enzima peroxidase de rábano silvestre e corroborar a sua actividade.
Introdução
Os hidrogéis feitos inteiramente de proteínas carregam o potencial para avançar significativamente campos tão diversos como a engenharia de tecidos, distribuição de medicamentos e biofabrication 1. Eles oferecem vantagens sobre os hidrogéis de polímero sintético tradicionais, incluindo biocompatibilidade e o potencial para apoiar de forma não invasiva a incorporação de proteínas globulares bioactivos.
Neste trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um novo hidrogel de proteína formada por meio de uma resposta mediada intein dividida proteína reacção de splicing trans e sua aplicação como suporte de imobilização de proteína....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Plasmídeo Construção
NOTA: Todos os genes foram amplificados em reações de PCR padrão usando Phusion High-Fidelity DNA polimerase por especificações do fabricante. Os iniciadores utilizados para a clonagem foram descritas anteriormente 9. Todas as construções estão listadas na Tabela 1.
- Para gerar cuta-NpuN (N, Tabela 1):
- PCR amplificar genes CUTA e NpuN de plasmídeos pET30-cuta-Tip1 10 e KanR-IntRBS-NpuNC CFN-11, respectivamente, utilizando os iniciadores adequados.
- Digerir estes fragmentos com as enzimas de restrição adequadas, e inseri s....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Um esquema para a formação do hidrogel de proteína intein mediada é apresentado na Figura 1A. Os blocos de construção de hidrogel são os copolímeros de proteína cuta-NpuN (N) e NpuC-S-cuta (C) (Figura 1A, Tabela 1). NpuN / C são os N-/C-fragments do DNAE dividir naturalmente intein de Nostoc punctiforme (NPU). Cuta é uma proteína trimérica estável de Pyrococcus horikoshii 4,5. Mistura de purificada N e C, na presença do agente redutor DTT induz a formação de uma terc.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Neste trabalho, nós demonstramos a síntese de uma proteína de hidrogel intein mediada altamente estável. O uso de uma divisão permite intein o hidrogel ser condicionalmente formada em resposta à mistura de dois componentes em fase líquida. Especificamente, a divisão intein covalentemente liga dois blocos em fase líquida através de uma reação de trans-splicing, produzindo uma unidade polipeptídeo ladeado por reticulação unidades que, por sua vez auto monta em um hidrogel. A formação induzida por mistura do hidro.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não existem interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer o Dr. David Tirrell (Caltech), pelo seu dom tipo de plasmídeo pQE9 AC 10 ATRP 12, o Dr. Tom Muir (Universidade de Princeton), pelo seu dom tipo de plasmídeo KanR-IntRBS-NpuNC-CFN 11, Dr. Takehisa Matsuda (Kanazawa Institute of Technology, Hakusan, Ishikawa, Japão), pelo seu dom tipo de plasmídeo pET30-cuta-Tip1 10, e Dr. Jay Keasling D. (UC Berkley) pelo seu dom tipo de plasmídeo pJD757 13 . Este trabalho foi apoiado em parte pela National Science Foundation CARREIRA, EUA Força Aérea YIP e Norman Hackman Programa Advanced Research.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Phusion High Fidelity DNA polimerase | New England BioLabs | M0530S | |
| Competente Escherichia coli BL21 (DE3) | New England BioLabs | C2527I | |
| Luria Bertani | VWR | p>90003-350 | |
| Bacto Agar Media | VWR | ||
sulfato de canamicina | VWR | ||
| IPTG | VWR | p>EM-5820 | |
| Imidazol | VWR | p>EM-5720 | |
| Ureia | VWR | p>EM-9510 | |
| Ditiotreitol (DTT) | Fisher | BP172-5 | |
| Coquetel de inibidores de protease | Roche Applied Science | 11836153001 | |
| DPBS | VWR | p>82020-066 | |
| Brilliant Blue R | Acros Organics | A0297990 | |
| Azida de sódio | Fisher | AC190380050 | Cuidado, altamente tóxico |
| Peroxidase de rábano | Sigma | P8125-5KU | |
N,N-dimetil-p-fenilenodiamina | Fisher | AC408460250 | Cuidado, altamente tóxico |
| fenol | Fisher | AC149340500 | Cuidado, altamente tóxico |
terc-butil hidroperóxido | Fisher | AC180340050 | Cuidado, altamente tóxico |
| n-heptano | Acros Organics | 120340010 |
|
| [header] | |||
| Shaker/Incubator | Fisher Scientific | Max Q 6000 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC 6 | |
| Sonicator | QSonica | Misonix 200 | |
| Tubos de Ultrafiltração | Amicon Ultra | UFC903024 | |
| Coluna Ni Sepharose High Performance HisTrap | GE Healthcare Life Sciences | 17-5248-01 | |
| HiTrap SP Sepharose FF coluna de troca iônica | GE Healthcare Life Sciences | 17-5156-01 | |
| Leitor de placas | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM |
Referências
- Banta, S., Wheeldon, I. R., Blenner, M. Protein Engineering in the Development of Functional Hydrogels. Ann. Rev. Biomed. Eng. 12, 167-186 (2010).
- Iwai, H., Zuger, S., Jin, J., Tam, P. H. Highly efficient protein trans-splicing by a naturally split DnaE....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
