מדידת ההשפעות של חיידקים על<em> ג Elegans</em> התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה
Summary
ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם המודל<em> Elegans Caenorhabditis</em> לחומרים מזיקים סביבתיים כגון אלה המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים.
Abstract
התנהגות הטלת ביצי סי אלגנס מושפעת רמזים סביבתיים כגון osmolarity 1 ורטט 2. בהיעדר המוחלט של מזון ג elegans גם יחדל הטלת ביצים ולשמר את ביציות מופרות ברחם 3 שלהם. עם זאת, ההשפעה של מקורות שונים של מזון, בעיקר חיידקים פתוגניים ובעיקר אנטרוקוקוס faecalis, על התנהגות הטלת ביצים לא מאופיינת היטב. ביצה בתולעת assay (EIW) הוא כלי שימושי כדי לכמת את ההשפעות של סוגים שונים של חיידקים, במקרה זה א faecalis, על התנהגות הטלת ביצים.
מבחני EIW כרוכים לספור את מספר הביצים נשמרים ברחם של ג elegans 4. Assay EIW כרוך הלבנת מבוימת, הרה המבוגר ג elegans כדי להסיר את העור המת ולהפריד את ביצי עודפים מבעלי החיים. לפני הלבנת, תולעים חשופים לחיידקים (או כל סוג של אות סביבתית) לתקופה קצובה של זמן. אחרי הלבנה, אחד היא בקלות רבה תוכל לספור את מספר ביצי עודפים בתוך הרחם של התולעים. ב assay זה, גידול בשייר כימות ביצה לאחר E. ניתן למדוד את חשיפת faecalis בקלות. Assay assay EIW הוא התנהגות שעשויה לשמש מסך לפוטנציאל חיידקים פתוגניים או הנוכחות של רעלים סביבתיים. בנוסף, assay EIW עשוי להיות כלי למסך לתרופות המשפיעות על נוירוטרנסמיטר איתות מאז התנהגות הטלת ביצים היא מווסתת על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון סרוטונין ואצטילכולין 5-9.
Introduction
Caenorhabditis elegans, תולעת עגולה מיקרוסקופית, נטול חיים, היא אורגניזם מודל משמש באופן מסורתי כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים ואיתות תא בגלל האנטומיה שלו שקופה, הפיתוח מאופיין היטב, מלא ברצף הגנום, דור בזמן הקצר, וההומולוגיה גנטית לבני אדם . לאחרונה, ג elegans הפך אורגניזם מודל בתחום הרעלים סביבתיים ומולדת חסינות 10, 11.
תולעי hermaphroditic דישון עצמי האלה הפכו לבגרות מינית בתוך שנים עד שלושה ימים מיום הבקיעה מן הביצה. במהלך מחזור החיים שלו, ג elegans עובר דרך ארבעה שלבי זחל (L1-L4), לפני שהגיע לבגרות. אחד המבודד אנדרוגינוס יכול לייצר, בממוצע, 300 צאצאים בתוך שלושה ימים של פוריות שיא. בreproductively הבוגר ג elegans הרמפרודיטים, ביצים מופרות נשמרות בתוך הרחם במשך כמה שעות לפני שהניחו.מספר הרגיל של ביצים מאוחסנות ברחם בכל זמן נתון (בשיא פוריות) הוא 12 בין עשרה לחמש עשר. מספר הביצים ברחם הוא פונקציה של שניהם בקצב ייצור של ביצה והשיעור של הנחת ביצה. ביצים מופרות הם גורשו מן הרחם על ידי התכווצות שרירי פות של שישה עשר מסודרים סביב הפתיחה של הפות 13. motorneurons הרמפרודיט הספציפי (HSN של) וסינפסה VC motorneurons על שרירי פות המשפיעים התכווצות שרירים ובכך הטלה התנהגות 5,7,13,14. גירוש של ביצים מהרחם מתרחש עקב פעילות מתואמת של נוירונים ושרירים.
תרבויות מעבדה של ג elegans גדלים בדרך כלל בדיאטה של nonpathogenic חיידקי Escherichia OP50. בסביבה הטבעית, ג elegans בא במגע עם מגוון רחב של מקורות מזון, כגון חיידקים פתוגניים, שיכול להיות מזיק. בעת חשיפה לחומרים מזיקים בהסביבה, ג elegans לשמור על ביצים עד שהסביבה הופכת להיות חיובית יותר. יש להניח שימור ביצה זו הוא מאמץ כדי להגן על הצאצאים שלהם.
בביצה זה בתולעת (EIW) assay, ג elegans חשוף לחיידקים פתוגניים פוטנציאל, אנטרוקוקוס faecalis, שנמצא בסביבה. חשיפה לצורות פתוגניים של א ' faecalis יכול לגרום לדלקת מעיים מתמשכת ואף למוות בג elegans 15. חשיפה לצורות אחרות של חיידקים פתוגניים הוכח להשפיע שימור ביצת 16,17, עם זאת ההשפעה לא לכמת. בנוסף, ההשפעה של מתינות פתוגניים זנים של E. faecalis, זנים שאינם קטלניים באופן מיידי, על התנהגות הטלת ביצים לא נחקרו.
מבחני EIW כרוכים לספור את מספר הביצים נשמרים ברחם של ג elegans 4. למרות שג elegansהם שקופים, ביצים מצטברות ברחם יכולות להיות קשים לכמת בבעלי חיים בשלמותה. Assay EIW כרוך הלבנת ההרה המבוגר ג elegans שנחשפו לחיידקים לתקופה קצובה של זמן. פתרון אקונומיקה ממסים את הציפורן החיצונית עוזב את הביצים מאחור. את הביצים הן שבירה להשפעות של אקונומיקה בשל הנוכחות של קליפת ביצה מגן. אחרי הלבנה, אחד היא בקלות רבה תוכל לספור את מספר הביצים ששוחררו מהרחם של התולעים על הלבנת.
Assay תאר הוא שיטה פשוטה וזולה, ומהירה לכמת את מספר הביצים ברחם בזמן אחד, ובכך לכמת את ההשפעות של א ' faecalis בשייר ביצה. assay זה יכול לשמש כדי לכמת את ההשפעה של סוגים אחרים של חיידקים, רעלים סביבתיים או תרופות בשייר ביצה. assay זה גם יש לו הפוטנציאל לשמש כמסך לpathogenicity חיידקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בביצוע assay זה בהצלחה הם: 1) באמצעות מניות מדושנות של ג elegans, 2) culturing סוגים בודדים של חיידקים בצלחת assay, 3) זיהוי מדויק מבוים L4 תולעים לחשיפה לE. faecalis, 4) שמירה על זמן החשיפה לE. faecalis עקבי בכל הניסויים ו 5) הלבנת זמן שלא יעלה על עשר דקות כדי למ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות ליוני מידלטון לאספקת ה זני faecalis והדרכה עם תרבות חיידקים. ג elegans סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי NIH משרד תוכניות תשתית מחקרית (P40 OD010440).
Materials
| Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
| Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
| Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
| C. elegans, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Culture plates for C. elegans | Tritech Research Inc. | T3308 | |
| Culture plates for E. faecalis | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| E. faecalis strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
| by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
|
all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux). |
|||
| Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
| Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
| Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
| Yeast extract | Acros | 61180-1000 |
References
- Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 216, 1012-1014 (1982).
- Sawin, E. R. . Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1996).
- Trent, C. . Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1982).
- Chase, D. L., Koelle, M. R. Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).
- Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 104, 619-647 (1983).
- Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).
- Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans. Neuron. 21, 203-214 (1998).
- Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).
- Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior. Genetics. 169, 1425-1436 (2005).
- Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).
- Schafer, W. R. . WormBook. , (2005).
- White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).
- Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons. Nature. 336, 638-646 (1988).
- Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- O’Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis. Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).
- Brenner, S. Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments. BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).
- Harvey, S. C., Orbidans, H. E. All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 6, e25840 (2011).
- Klass MR, . Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).
