Mesurer les effets des bactéries sur<em> C. Elegans</em> Comportement aide d'un test de rétention d'oeufs

Summary

Un test d'oeuf en ver (EIW) est une méthode utile pour quantifier comportement de ponte. Altérations de la ponte peut être une réponse comportementale de l'organisme modèle<em> Caenorhabditis elegans</em> À des substances environnementales potentiellement nocives telles que celles produites par des bactéries pathogènes.

Abstract

C. comportement de ponte elegans est affecté par des signaux environnementaux tels que l'osmolarité ¹ et vibrations ^2. En l'absence totale de nourriture C. elegans cessent également de ponte et de conserver les œufs fécondés dans l'utérus ^3. Cependant, l'effet des différentes sources de nourriture, en particulier les bactéries pathogènes et notamment Enterococcus faecalis, sur le comportement de ponte n'est pas bien caractérisée. L'œuf en ver essai (EIW) est un outil utile pour quantifier les effets de différents types de bactéries, dans ce cas E. faecalis, sur le comportement de ponte.

Dosages EIW impliquent compter le nombre d'œufs conservés dans l'utérus de C. elegans ^4. Le test consiste à EIW blanchiment mis en scène, gravide adulte C. elegans pour enlever la cuticule et séparent les œufs conservés provenant de l'animal. Avant de blanchiment, les vers sont exposés à des bactéries (ou tout autre type de signal environnemental) Pendant une période de temps déterminée. Après le blanchiment, on est très facilement en mesure de compter le nombre d'œufs conservés à l'intérieur de l'utérus des vers. Dans cet essai, une augmentation quantifiable de la rétention d'œuf après E. exposition faecalis peut être facilement mesuré. Le test EIW est un test comportemental qui peut être utilisé pour le dépistage de bactéries potentiellement pathogènes ou la présence de toxines dans l'environnement. En outre, le test EIW peut être un outil pour dépister les drogues qui affectent neurotransmetteur signalisation depuis comportement de ponte est modulée par des neurotransmetteurs comme la sérotonine et l'acétylcholine ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, un microscopique, ascaris vivant en liberté, est un organisme modèle traditionnellement utilisé pour étudier les processus de signalisation du développement et de la cellule en raison de son anatomie transparent, développement bien caractérisé, entièrement séquencé génome, la génération en temps court, et l'homologie génétique à l'homme . Plus récemment, C. elegans est devenu un organisme modèle dans le domaine de la toxicologie environnementale et l'immunité innée ^{10, 11.}

Ces auto-fertilisation vers hermaphrodites deviennent sexuellement matures dans les deux à trois jours après l'éclosion de l'oeuf. Au cours de son cycle de vie, C. elegans passe par quatre stades larvaires (L1-L4), avant d'atteindre l'âge adulte. Un isolé hermaphrodite peut produire, en moyenne, 300 enfants dans les trois jours de fécondité maximale. En sexuellement matures C. elegans hermaphrodite, les œufs fécondés sont retenus dans l'utérus pendant plusieurs heures avant d'être jeté. Lenombre normal des oeufs stockées dans la matrice à un moment donné (en période de pointe fécondité) est comprise entre dix et quinze ^12. Le nombre d'oeufs dans l'utérus est une fonction à la fois le taux de production d'oeufs et le taux de ponte. Les œufs fécondés sont expulsés de l'utérus par la contraction des muscles seize vulvaires disposées autour de l'ouverture de la vulve ^13. Motoneurones Hermaphrodite spécifiques (HSN départ) et les motoneurones VC synapse sur les muscles vulvaires affectant la contraction musculaire et donc la ponte comportement ^5,7,13,14. Expulsion des œufs de l'utérus est dû à l'activité coordonnée de neurones et les muscles.

cultures de laboratoire de C. elegans sont typiquement élevés à un régime de non pathogène Escherichia coli OP50. Dans le milieu naturel, C. elegans entrent en contact avec une variété de sources alimentaires, tels que les bactéries pathogènes, qui peuvent être potentiellement dangereux. Lorsqu'ils sont exposés à des substances nocives enl'environnement, C. elegans conserver les oeufs jusqu'à ce que l'environnement devient plus favorable. On peut supposer que cette rétention d'œuf est un effort pour protéger leur progéniture.

Dans cet œuf à vis sans fin (EIW) dosage, C. elegans sont exposés aux bactéries pathogènes potentiellement, Enterococcus faecalis, qui se trouve dans l'environnement. L'exposition à des formes pathogènes de E. faecalis peuvent causer une infection intestinale persistante et même la mort en C. elegans ^15. L'exposition à d'autres formes de bactéries pathogènes ont été montré pour affecter la rétention d'œuf ^16,17, cependant l'effet n'a pas été quantifiée. En outre, les souches de l'effet de légèrement pathogène de E. faecalis, les souches qui ne sont pas immédiatement mortelle, sur le comportement de ponte n'a pas été étudiée.

Dosages EIW impliquent compter le nombre d'œufs conservés dans l'utérus de C. elegans ^4. Même si C. eleganssont transparentes, les œufs s'accumulent dans l'utérus peut être difficile à quantifier dans un animal intact. Le test consiste à EIW blanchiment gravide adulte C. elegans qui ont été exposées à la bactérie pendant une période de temps déterminée. La solution d'eau de Javel dissout la cuticule externe laissant les œufs derrière. Les oeufs sont réfraction aux effets de blanchiment en raison de la présence d'une coquille de protection. Après le blanchiment, on est très facilement en mesure de compter le nombre d'œufs libérés de l'utérus des vers sur le blanchiment.

L'essai décrit une méthode simple, peu coûteux et rapide à quantifier le nombre d'ovules dans l'utérus à un moment donné, et donc de quantifier les effets de E. faecalis sur la rétention d'œufs. Ce test peut être utilisé pour quantifier l'effet d'autres types de bactéries, de toxines environnementales ou des médicaments sur la rétention d'œufs. Ce test a également le potentiel d'être utilisé comme un écran pour pouvoir pathogène bactérien.

Protocol

1) Préparation de nématodes croissance médias (NGM) Pour faire 50 assiettes, ajouter 1,5 g NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, et 1,25 g de peptone à 1 Lflask. Ajouter 487,5 ml de dH 2 O dans le ballon. Agiter doucement pour mélanger et couvrir l'ouverture de la fiole avec un morceau de papier d'aluminium. Stériliser la solution à l'autoclave à des conditions standards (121 psi, 120 ° C, 20 min). Laisser la solution refroidir à 45 ° C dans un bain d'…

Representative Results

Ce test permet de quantifier le nombre d'œufs retenus dans C. elegans après exposition à E. faecalis. L4 scène vers (caractérisé par l'espace ouvert et transparent au-dessus de la vulve, figure 1) ont été exposés à E. faecalis l'âge adulte. Après 40 heures d'exposition à E. faecalis, le blanchiment a été réalisée. Comme la cuticule désintégré dans la goutte d'eau de javel, les œufs sont devenus plus apparents (figure 2)…

Discussion

Les étapes les plus importantes dans l'accomplissement avec succès ce test sont les suivants: 1) l'utilisation des stocks bien nourris de C. elegans, 2) la culture des types individuels de bactéries sur la plaque de dosage, 3) l'identification précise scène L4 vers l'exposition à E. faecalis, 4) en maintenant la durée d'exposition à E. faecalis uniformes dans tous les essais et 5) le temps de blanchiment ne doivent pas dépasser dix minutes pour éviter la désinté…

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000