Måle effekten av bakterier på<em> C. Elegans</em> Behavior Ved hjelp av en Egg Retention analysen

Summary

Et egg-i-ormen (EIW) analysen er en nyttig metode for å kvantifisere eggleggingen atferd. Endringer i egg legging kan være et atferdsmessig respons av modellen organisme<em> Caenorhabditis elegans</em> For potensielt skadelige miljømessige stoffer slik som de som produseres av patogene bakterier.

Abstract

C. elegans egglegging atferd påvirkes av miljømessige signaler som osmolaritet ^pt og vibrasjon ^to. I det totale fravær av mat C. elegans også opphøre egg-legging og beholde befruktede egg i sin livmor ^tre. Imidlertid er virkningen av forskjellige kilder av mat, spesielt patogene bakterier og spesielt Enterococcus faecalis, på egglegging oppførsel ikke godt karakterisert. Den egg-i-orm (EIWs) assay er et nyttig verktøy for å kvantifisere virkningene av forskjellige typer av bakterier, i dette tilfellet E. faecalis, på egglegging atferd.

EIWs analyser involverer å telle antall egg holdes tilbake i livmoren av C. elegans ^4. Den EIWs analysen innebærer bleking iscenesatt, gravid voksen C. elegans å fjerne skjellaget og skille de tilbakeholdte egg fra dyr. Før bleking, er ormer utsatt for bakterier (eller noen form for miljømessig cue) For en fast periode. Etter bleking, er en meget lett i stand til å telle antall egg tilbakeholdt inne i livmoren av ormer. I denne analyse ble en målbar økning i egg-retensjon etter E. faecalis eksponering kan lett måles. Den EIWs analysen er et atferdsmessig analysen som kan brukes til å screene for sykdomsfremkallende bakterier eller tilstedeværelse av miljøgifter. I tillegg kan den EIWs analysen være et verktøy for screening av stoffer som påvirker signalisering nevrotransmitter ettersom egglegging oppførsel er modulert av neurotransmittere, slik som serotonin og acetylcholin ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, en mikroskopisk, frittlevende rundorm, er en modell organisme tradisjonelt brukt til å studere utviklings-og cellesignalisering prosesser på grunn av sin gjennomsiktige anatomi, godt karakterisert utvikling, fullt sekvensert genomet, kort generasjon-tid, og genetisk homologi til mennesker . Mer nylig C. elegans har blitt en modell organisme innen Miljøtoksikologi medfødt immunitet og ^{10, 11..}

Disse selv-gjødsling tvekjønnet ormer blir kjønnsmodne i løpet av to til tre dager før klekking fra egg. I løpet av sin livssyklus, C. elegans passerer gjennom fire larvestadier (L1-L4), før de når voksen alder. En isolert hermafroditt kan produsere i gjennomsnitt 300 avkom i løpet av tre dager med topp fruktbarhet. I reproductively moden C. elegans hermafroditter, er befruktede egg beholdes i livmoren i flere timer før de ble lagt. Dennormalt antall egg som er lagret i livmoren til enhver tid (i løpet av peak fecundity) er mellom ti og femten ^12.. Antallet egg i livmoren er en funksjon av både frekvensen av eggproduksjon og frekvensen av egglegging. Befruktede egg er utvist fra livmoren ved sammentrekning av seksten vulval muskler arrangert rundt åpningen av vulva ^13. Hermafroditt-spesifikke motorneurons (HSN tallet) og VC motorneurons synapse på vulval muskler som påvirker muskel sammentrekning og dermed eggleggingen atferd ^5,7,13,14. Utvisning av egg fra livmoren oppstår på grunn av koordinert aktivitet av nerveceller og muskler.

Lab kulturer av C. elegans er vanligvis reist på en diett av nonpathogenic Escherichia coli OP50. I naturen, C. elegans kommer i kontakt med en rekke matvarer kilder, for eksempel patogene bakterier, som kan være potensielt skadelige. Når de utsettes for skadelige stoffer imiljø, C. elegans beholde egg til miljøet blir mer gunstig. Antagelig egg oppbevaring er et forsøk på å beskytte sine avkom.

I denne egg i ormen (EIW) analysen, C. elegans er utsatt for potensielt skadelige bakterien Enterococcus faecalis, som finnes i miljøet. Eksponering for sykdomsfremkallende former for E. faecalis kan forårsake vedvarende tarminfeksjon og død i C. elegans ^15. Eksponering for andre former av patogene bakterier har blitt vist å påvirke egg retensjon ^16,17, men effekten ikke ble kvantifisert. I tillegg kan effekten av mildt patogene stammer av E. faecalis, har stammer som ikke er umiddelbart dødelig, på egglegging oppførsel ikke undersøkt.

EIWs analyser involverer å telle antall egg holdes tilbake i livmoren av C. elegans ^4. Selv om C. eleganser gjennomsiktige, kan egg akkumulert seg i livmoren være vanskelig å kvantifisere i et intakt dyr. Den EIWs analysen innebærer bleking gravid voksen C. elegans som ble eksponert for bakterier for en fast periode. Blekemiddel oppløser den ytre skjellaget forlater eggene bak. Eggene er refraktiv for virkningene av blekemiddel på grunn av tilstedeværelsen av en beskyttende eggeskall. Etter bleking, er en meget lett i stand til å telle antall egg frigjøres fra uterus av ormene ved bleking.

Analysen beskrevet er en enkel, billig og hurtig metode til å kvantifisere antallet egg i livmoren på en gang, og dermed kvantifisere effekten av E. faecalis på egg oppbevaring. Denne analysen kan brukes til å kvantifisere effekten av andre typer av bakterier, miljømessige toksiner eller medikamenter på egg oppbevaring. Metoden har også potensiale til å bli brukt som en skjerm for bakteriell patogenisitet.

Protocol

1) Utarbeidelse av Nematode vekstmedier (NGM) For å gjøre 50 plater, tilsett 1,5 g NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar, og 1,25 g peptone til en 1 Lflask. Legg 487,5 ml dH 2 O til kolbe. Virvel forsiktig for å blande og dekker åpningen av kolbe med et stykke aluminiumfolie. Steriliser oppløsningen ved autoklavering ved standardbetingelser (121 psi, 120 ° C, 20 min). Tillat løsningen å avkjøles til 45 ° C i et vannbad. Til løsningen, legge til følgende i re…

Representative Results

Denne analysen gjør det mulig å kvantifisere antallet tilbakeholdte egg innenfor C. elegans etter eksponering til E. faecalis. L4 iscenesatt ormer (preget av gjennomsiktig åpen plass ovenfor sin vulva, en figur) ble utsatt for E. faecalis gjennom voksenlivet. Etter førti timer med eksponering for E. faecalis ble bleking utført. Som hårstråene oppløst i blekemiddel dråpene, ble eggene mer åpenbar (figur 2). Antallet tilbakeholdt egg var lett …

Discussion

De mest kritiske trinnene i hell utfører denne analysen er: 1) ved hjelp av velfødde bestander av C. elegans, 2) dyrking av enkle typer av bakterier på analysens platen, 3) nøyaktig identifisering trinnvis L4 ormer for eksponering mot E. faecalis, 4) å holde eksponeringstid til E. faecalis konsistente på tvers av alle prøvelser og 5) bleking tid bør ikke overstige ti minutter for å hindre egg oppløsning.

For denne analysen er det viktig å velge sunt, god…

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000