Mätning av effekterna av bakterier på<em> C. Elegans</em> Beteende användning av en analys Egg Retention

Summary

Ett ägg-i-mask (EIW)-analys är en användbar metod för att kvantifiera äggläggande beteende. Förändringar i äggläggningen kan vara en beteendegensvar av modellen organismen<em> Caenorhabditis elegans</em> Att potentiellt skadliga miljö-ämnen såsom de som produceras av patogena bakterier.

Abstract

C. elegans äggläggning beteende påverkas av miljö-signaler såsom osmolaritet ¹ och vibrationer ^2. I total avsaknad av mat C. elegans upphör också äggläggningen och behålla befruktade ägg i sin livmoder ^3. Däremot är effekten av olika källor av mat, speciellt patogena bakterier och särskilt Enterococcus faecalis, på äggläggning beteende inte väl karakteriserade. Ägget-in-masken (EIW)-analys är ett användbart verktyg för att kvantifiera effekterna av olika typer av bakterier, i det här fallet E. faecalis, på äggläggning beteende.

EIW analyser involverar räkna antalet ägg som kvarhålles i uterus hos C. elegans ^4. Den EIW analysen involverar blekning iscensatt, gravid vuxen C. elegans för att ta bort nagelbanden och separera de balanserade ägg från djur. Före blekning, är maskar utsätts för bakterier (eller någon typ av miljö-cue) Under en bestämd tidsperiod. Efter blekning, är en mycket lätt kunna räkna antalet ägg som behålls inne i livmodern av maskar. I denna analys, en kvantifierbar ökning ägg kvarhållande efter E. faecalis exponering kan lätt mätas. Den EIW-analysen är en beteendevetenskaplig analys som kan användas för att screena för potentiellt sjukdomsframkallande bakterier eller förekomsten av miljögifter. Dessutom kan EIW analysen vara ett verktyg för att screena för läkemedel som påverkar signalsubstansen signalering eftersom äggläggning beteende moduleras av signalsubstanser som serotonin och acetylkolin ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, en mikroskopisk, fritt levande rundmask, är en modell organism som traditionellt används för att studera utvecklings-och cell signalering processer på grund av dess transparenta anatomi, väl karakteriserad utveckling, fullt sekvenserat genomet, kort generationstid-tid, och genetisk homologi till människor . På senare tid, C. elegans har blivit en modell organism inom miljötoxikologi och medfödd immunitet ^{10, 11.}

Dessa självbefruktande hermafroditiska maskar blir könsmogna inom två till tre dagar efter kläckningen ur ägget. Under sin livscykel, C. elegans passerar fyra larvstadier (L1-L4), före vuxen ålder. Ett isolerat hermafrodit kan producera i genomsnitt 300 avkommor inom tre dagar från topp fruktsamhet. I reproduktivt mogen C. elegans hermafroditer är befruktade ägg kvar i livmodern under flera timmar innan de läggs. Dennormal antal ägg lagrade i livmodern vid en viss tidpunkt (under topp fruktsamhet) är mellan tio och femton ^12. Antalet ägg i livmodern är en funktion av både hastigheten av äggproduktion och hastigheten för äggläggning. Befruktade ägg ut från livmodern genom sammandragning av sexton vulva muskler arrangerade kring öppnandet av vulva ^13. Hermafrodit-specifika motorneurons (HSN: s) och VC motorneurons synaps på vulva muskler påverkar muskelsammandragning och därmed äggläggande beteende ^5,7,13,14. Utvisning av ägg från livmodern uppstår på grund av samordnade aktiviteten av nervceller och muskler.

Lab kulturer av C. elegans är oftast upp på en diet av nonpathogenic Escherichia coli OP50. I den naturliga miljön, C. elegans kommer i kontakt med en mängd olika livsmedel källor, såsom patogena bakterier, som kan vara potentiellt skadliga. När de utsätts för skadliga ämnen imiljön, C. elegans behåller äggen tills miljön blir mer gynnsam. Förmodligen ägg kvarhållande är ett försök att skydda sin avkomma.

I detta ägg i masken (EIW)-analys, C. elegans utsätts för potentiellt patogena bakterier, Enterococcus faecalis, som finns i miljön. Exponering för patogena former av E. faecalis kan orsaka ihållande tarminfektion och med död i C. elegans ^15. Exponering för andra former av patogena bakterier har visats påverka ägg kvarhållande ^16,17, men effekten inte kvantifierades. Dessutom, effekten av milt patogena stammar av E. faecalis har stammar som inte är omedelbart dödande, på äggläggning beteende inte studerats.

EIW analyser involverar räkna antalet ägg som kvarhålles i uterus hos C. elegans ^4. Även om C. elegansär transparent, kan äggen samlas i livmodern vara svåra att kvantifiera i ett intakt djur. Den EIW analysen involverar blekning gravid vuxen C. elegans som exponerats för bakterien under en bestämd tidsperiod. Den blekmedel upplöser yttre nagelband lämnar äggen bakom. Äggen är brytningsindex för effekterna av blekmedel på grund av närvaron av en skyddande äggskal. Efter blekning, är en mycket lätt kunna räkna antalet ägg frigörs från livmodern av maskarna vid blekning.

Analysen som beskrivs är en enkel, billig och snabb metod för att kvantifiera antalet ägg i livmodern på en gång, och därmed kvantifiera effekterna av E. faecalis på ägg retention. Denna analys kan användas för att kvantifiera effekten av andra typer av bakterier, miljögifter eller läkemedel på ägg retention. Denna analys har också potential att användas som en skärm för bakteriell patogenicitet.

Protocol

1) Framställning av Media Nematoder Tillväxt (NGM) För att göra 50 tallrikar, tillsätt 1,5 g NaCl, 8,5 g ultrarent Agar, och 1,25 g pepton till en 1 Lflask. Lägg 487,5 ml dH 2 O till kolv. Snurra försiktigt för att blanda och täcka öppningen av kolven med en bit aluminiumfolie. Sterilisera lösningen genom autoklavering vid standardbetingelser (121 psi, 120 ° C, 20 min). Låt lösningen svalna till 45 ° C i ett vattenbad. Till lösningen, lägg ti…

Representative Results

Denna analys gör det möjligt att kvantifiera antalet kvarhållna ägg inom C. elegans efter exponering för E. faecalis. L4 iscensatt maskar (kännetecknas av transparent öppet utrymme ovanför deras vulva, figur 1) exponerades för E. faecalis genom vuxenlivet. Efter fyrtio timmars exponering för E. faecalis, var blekning utförs. Eftersom nagelband desintegrerade i blekmedel droppen blev äggen tydligare (figur 2). Antalet balanserade ägg var l…

Discussion

De mest kritiska stegen i framgångsrikt utföra denna analys är följande: 1) med användning av väl-matade lager av C. elegans, 2) odling enstaka typer av bakterier på assayplattan, 3) korrekt identifiera iscensatt L4 maskar för exponering för E. faecalis, 4) att hålla exponeringstiden till E. faecalis genomgående i alla studier och 5) blekning tiden bör inte överstiga tio minuter för att förhindra ägget sönderfall.

För denna analys är det viktigt …

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
			by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
			all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars (arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed presumptive identification of all E. faecalis strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000