Indirecte immunofluorescentie (IIF) assays traditioneel gebruikt voor de detectie van antinucleaire antilichamen (ANA) in menselijk serum. De aanwezigheid van deze antilichamen kunnen helpen bij de diagnose van systemische auto reumatische aandoeningen (SARD). Dit protocol laat zien hoe effectief uit te voeren de IIF techniek om deze autoantilichamen nauwkeurig te detecteren.
De American College of Rheumatology positie verklaring over ANA testen, wordt het gebruik van IIF als de gouden standaard methode voor het ANA screening 1. Hoewel IIF is een uitstekende screeningstest in deskundige handen, de technische problemen van de verwerking en het lezen IIF dia's – zoals de arbeidsintensieve verwerking glijbaan, handleiding lezen, de behoefte aan ervaren, opgeleide technologen en het gebruik van donkere kamer – maken het IIF methode moeilijk in te passen in de workflow van de moderne, geautomatiseerde laboratoria.
De eerste en cruciale stap op weg naar een hoge kwaliteit ANA screening is voorzichtig glijbaan verwerking. Deze procedure is arbeidsintensief en volledig begrip van de werkwijze en aandacht voor details en ervaring vereist.
Dia lezing wordt uitgevoerd door fluorescentie microscopie in donkere kamers, en wordt gedaan door opgeleide technologen die vertrouwd zijn met de verschillende patronen, in het kader van de celcyclusen de morfologie van interfase en delende cellen. Mits IIF is de eerste lijn screening tool voor SARD, het begrijpen van de stappen om deze techniek correct uit te voeren is van cruciaal belang.
Recent zijn digitale beeldvormingssystemen ontwikkeld voor het automatisch lezen van IIF dia. Deze systemen, zoals het NOVA View Automated fluorescentiemicroscoop, zijn ontworpen om de routine IIF stroomlijnen. NOVA Bekijk verwerft en slaat digitale beelden van de putten hoge resolutie, waardoor beeldaanwinst scheiden van interpretatie; beelden worden bekeken een geïnterpreteerde op hoge resolutie beeldschermen. Het slaat beelden voor toekomstige referentie en ondersteunt de interpretatie van de exploitant door middel van fluorescerende lichtintensiteit gegevens op de afbeeldingen. Ook voorlopig categoriseert resultaten als positief of negatief, en biedt patroonherkenning voor positieve monsters. Samengevat, het elimineert de behoefte aan donkere kamer, en automatiseert en stroomlijnt het IIF reading / interpretatie workflow. Belangrijker nog, het verhoogt de consistentie tussen lezers en lezingen. Bovendien, met het gebruik van barcodes glijbanen, transcriptie fouten worden voorkomen door te bepalen monster traceerbaarheid en positieve patiënt identificatie. Dit resulteert in een verhoogde patiëntgegevens integriteit en veiligheid.
Het algemene doel van deze video is om de IIF-procedure aan te tonen, waaronder dia verwerking, de identificatie van gemeenschappelijke IIF patronen, en de introductie van nieuwe ontwikkelingen te vereenvoudigen en harmoniseren van deze techniek.
Het antinucleaire antilichaam term (ANA) beschrijft verschillende auto-antilichamen die reageren met bestanddelen van celkernen waaronder DNA, eiwitten en ribonucleoproteins 1, 2. De HEp-2 cellen, een natief eiwit array met honderden antigenen, een ideale substraat voor de detectie van ANA 1. De detectie van ANA in menselijk serum is een belangrijk onderzoekshulpmiddel voor bindweefselziekten en IIF is de referentiemethode ANA test 1. Onlangs heeft IIF op HEp-2-cellen vervangen in sommige laboratoria antigeenspecifieke multiplex immunoassays en werkwijzen. Als gevolg van bezorgdheid over vals negatieve resultaten en het gebrek aan transparantie aan werkers, de American College of Rheumatology vormden een Task Force concludeerde dat IIF gebruik HEp-2-cellen de "gouden standaard" voor ANA screening 1 zou moeten zijn.
Door de subjectieve aard van ANA screening, de kwaliteit van HEp-2-cellen inTEGRAL om nauwkeurige en vol vertrouwen rapportage van de resultaten. De aanwezigheid van een groot aantal mitotische cellen optimaal celmorfologie voldoende confluentie en expressie van relevante antigenen zijn bijzonder belangrijk. IIF patroonherkenning fungeert als een belangrijk instrument om te helpen bij de patiënt de diagnose. Inzicht in de betekenis van de verschillende patronen kan de artsen en laboratoriumpersoneel om de passende follow-up testen uit te voeren om de diagnose te bevestigen. Zo kunnen homogeen ANA patroon voorkomen in de aanwezigheid van anti-dsDNA antilichamen of chromatine, en kan gepaard gaan met systemische lupus erythematosus (SLE) 3. Van de andere kant, is onlangs beschreven dat de zogenaamde dichte fijn gespikkelde patroon (DFS), die vaak wordt gezien in maximaal 12% van de routine monsters, is meestal in verband gebracht met anti-DFS70 antilichamen. Deze auto-antilichamen, indien in isolatie (zonder andere ziektespecifieke ANA) zijn niet geassocieerd met systemische auto reumatische aandoeningen <sup> 4-9. Daarbij bevestigend onderzoek naar anti-DFS70 antilichamen kunnen helpen onnodige reflex tests te beperken, bieden aanzienlijke kostenbesparingen en gemak patiënt angst.
Gezien het feit dat IIF is de eerste lijn screening methodologie om autoantilichamen sporen, is het van het grootste belang dat de gebruiker begrijpt hoe de selectie van reagentia en weefsel substraten resultaten kunnen beïnvloeden. Aangezien de IIF techniek subjectief, is het belangrijk dat de gebruikte reagentia bieden de hoogste kwaliteit.
Dit doel van deze video-protocol is om de gebruiker vertrouwd te maken met de juiste stappen die nodig zijn om de IIF-methode, de gemeenschappelijke patronen geassocieerd met ANA voeren, en om nieuwe ontwikkelingen waarvoor het laboratorium workflow kunnen stroomlijnen en de resultaten te standaardiseren introduceren.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Cassandra Bryant voor het uitvoeren van de IIF experiment en Carol Buchner voor haar deskundige technische beoordeling.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |