Indirekte Immunfluoreszenz (IIF)-Assays wurden traditionell für den Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) in Humanserum verwendet. Das Vorhandensein dieser Antikörper können bei der Diagnose von rheumatischen systemischen Autoimmunerkrankungen (SARD) unterstützen. Dieses Protokoll zeigt, wie die IIF-Technik effektiv durchzuführen, um diese Autoantikörper genau zu erfassen.
Das American College of Rheumatology Positionspapier auf ANA-Test sieht vor, die Verwendung von IIF als Goldstandard-Methode für ANA-Screening ein. Obwohl IIF ist ein ausgezeichneter Screening-Test in erfahrenen Händen, die technischen Schwierigkeiten bei der Verarbeitung und Lese IIF gleitet – wie die arbeitsintensive Dia Verarbeitung, manuelle Lesen, die Notwendigkeit für erfahrene, geschulte Techniker und die Verwendung von dunklen Raum – machen das IIF-Methode schwierig, in den Workflow des modernen, automatisierten Labors passen.
Der erste und entscheidende Schritt in Richtung hohe Qualität ANA-Screening ist eine sorgfältige Dia-Verarbeitung. Dieses Verfahren ist arbeitsintensiv und erfordert volle Verständnis des Prozesses, sowie die Liebe zum Detail und Erfahrung.
Schieber Lesen wird durch Fluoreszenzmikroskopie in dunklen Räumen durchgeführt wird, und wird durch geschulte Techniker, die mit den verschiedenen Mustern vertraut sind, im Rahmen der Zellzyklus getanund die Morphologie der Interphase und teilende Zellen. Vorausgesetzt, dass IIF ist die erste Zeile Screening-Tool für SARD, das Verständnis der Schritte, um diese Technik korrekt durchzuführen, ist kritisch.
Vor kurzem haben Digital-Imaging-Systemen für die automatisierte Lesen von IIF Folien entwickelt. Diese Systeme, wie dem NOVA anzeigen Automatische Fluoreszenzmikroskop, sind entworfen, um die Routine IIF Arbeitsabläufe zu optimieren. NOVA anzeigen erwirbt und speichert hochauflösende digitale Bilder von den Brunnen, damit die Bildaufnahme der Trennung von Interpretation; Bilder werden auf eine hochauflösende Computer-Monitore ausgelegt angesehen. Es speichert Bilder für die Zukunft und unterstützt Interpretation des Betreibers durch Fluoreszenzlichtintensität Daten auf die Bilder. Es ist auch vorläufig kategorisiert Ergebnisse als positiv oder negativ, und stellt Mustererkennung für die positiven Proben. Zusammenfassend, beseitigt die Notwendigkeit für die Dunkelkammer, automatisiert und rationalisiert die IIF-Bereitschaftng / Interpretation Workflow. Am wichtigsten ist, erhöht es die Konsistenz zwischen Leser und Lesungen. Darüber hinaus mit dem Einsatz von Barcode-Dias, Übertragungsfehler werden durch die Bereitstellung Probe Rückverfolgbarkeit und positive Patientenidentifikation eliminiert. Dies führt zu erhöhten Patientendatenintegrität und Sicherheit.
Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, die IIF Verfahren demonstrieren, einschließlich Rutsche Verarbeitung, Identifizierung gemeinsamer IIF Muster und die Einführung von neuen Entwicklungen zu vereinfachen und zu vereinheitlichen diese Technik.
Der Begriff antinukleäre Antikörper (ANA) beschreibt eine Vielzahl von Autoantikörpern, die mit Bestandteilen der Zellkerne, einschließlich DNA, Proteinen und Ribonukleoproteine 1, 2 reagieren. Die HEp-2-Zelle, ein natives Protein-Array mit Hunderten von Antigenen, stellt ein ideales Substrat für die Detektion von ANA 1. Der Nachweis von ANA im menschlichen Serum ist ein wichtiger Screening-Tool für Erkrankungen des Bindegewebes, und IIF ist die Referenzmethode für ANA Testen ein. Kürzlich IIF auf HEp-2-Zellen wurde in einigen Laboratorien mit Antigen-spezifischen Immunassays und Multiplex-Verfahren ersetzt. Aus Sorge um falsch-negative Ergebnisse und der fehlenden Transparenz für Kliniker, das American College of Rheumatology bildeten eine Task Force, die dem Schluss, dass IIF mit HEp-2-Zellen sollte der "Goldstandard" für die ANA-Screening 1 sein.
Durch die subjektive Natur der ANA-Screening, ist die Qualität der HEp-2-Zellen inintegraler, genaue und vertrauliche Meldung der Ergebnisse. Die Anwesenheit einer hohen Anzahl von mitotischen Zellen, optimale Zellmorphologie ausreichend Konfluenz und Expression der entsprechenden Antigene sind besonders wichtig. IIF Mustererkennung dient als ein wichtiges Instrument, um in der Patientendiagnose zu unterstützen. Das Verständnis der Bedeutung der verschiedenen Muster ermöglicht es, die Ärzte und Laborpersonal, um die entsprechende Follow-up-Tests durchführen, um die Diagnose zu bestätigen. Zum Beispiel können homogene ANA Muster in der Gegenwart von Anti-dsDNA-Antikörpern auftreten oder Chromatin und kann mit systemischem Lupus erythematodes (SLE) 3 zugeordnet werden. Von der anderen Seite wurde kürzlich beschrieben, dass das so genannte dichte feine Fleckenmuster (DFS), die üblicherweise bis zu 12% der anfallenden Proben zu sehen ist, hat sich vor allem mit Anti-DFS70 Antikörpern assoziiert. Diese Autoantikörper, wenn sie isoliert (ohne andere krankheitsspezifische ANA) vorhanden sind, nicht mit systemischen Autoimmunrheumatischen Erkrankungen <sup> 9.4. Dabei Bestätigungstests für Anti-DFS70 Antikörper kann dazu beitragen, unnötige Reflextests, bieten erhebliche Kosteneinsparungen und erleichtern Patienten Angst.
Da IIF ist die erste Zeile Screening Methode für Autoantikörper erkennen, ist es wichtig, dass der Anwender weiß, wie die Auswahl der Reagenzien und Gewebesubstrate können die Ergebnisse beeinflussen. Da die IIF-Technik ist von Natur aus subjektiv, ist es wichtig, dass die verwendeten Reagenzien bieten die höchste Qualität der Ergebnisse.
Das Ziel dieses Video-Protokoll ist, den Benutzer mit den richtigen Schritte, um das IIF-Methode, die gemeinsamen Muster mit ANA, verknüpften Aufgaben vertraut zu machen und neue Entwicklungen, die die Arbeitsabläufe im Labor zu rationalisieren und zu standardisieren, Ergebnisse vorzustellen.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Cassandra Bryant für die Durchführung der IIF Experiment und Carol Buchner für ihre kompetente technische Bewertung.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
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QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
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