מבחני immunofluorescent העקיף (IIF) באופן מסורתי המשמשים לזיהוי של נוגדני antinuclear (ANA) בסרום אדם. הנוכחות של נוגדנים אלה יכול לסייע באבחון של מחלות מערכתיות אוטואימוניות שגרוניות (סארטי). פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע ביעילות את טכניקת IIF לזהות במדויק נוגדנים עצמיים אלה.
המכללה להצהרת עמדת ראומטולוגיה על בדיקות ANA האמריקנית קובעת את השימוש בIIF כשיטת תקן זהב עבור ANA הקרנת 1. למרות IIF הוא מבחן מיון מצוין בידיים של מומחה, הקשיים הטכניים של עיבוד וקריאת IIF מחליק – כגון עיבוד העבודה אינטנסיבי שקופיות, קריאה ידנית, את הצורך במנוסה, אנשי טכנולוגיה מיומנים ושימוש בחדר חשוך – להפוך את שיטת IIF קשה להתאים את זרימת העבודה של מעבדות מודרניות ואוטומטיות.
הצעד הראשון ומכריע לקראת הקרנת ANA באיכות גבוהה הוא עיבוד שקופיות זהיר. הליך זה הוא עבודה אינטנסיבית, ודורש הבנה מלאה של התהליך, כמו גם תשומת לב לפרטים וניסיון.
קריאת שקופיות מתבצעת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחדרים חשוכים, והוא נעשה על ידי אנשי טכנולוגיה מיומנים שמכירים את הדפוסים השונים, בהקשר של מחזור התאוהמורפולוגיה של שלבי ביניים וחלוקת תאים. ובלבד שIIF הוא כלי מיון הקו הראשונים לסארטי, הבנת הצעדים לביצוע בטכניקה זו בצורה נכונה הוא קריטי.
לאחרונה, מערכות הדמיה דיגיטליות פותחו לקריאה האוטומטית של שקופיות IIF. מערכות אלו, כמו NOVA צפה האוטומטי פלורסנט מיקרוסקופ, נועדו לייעל את זרימת העבודה IIF השגרתית. NOVA צפה רוכש וחנויות תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של הבארות, ובכך מפריד את רכישת תמונה מפרשנות; הם צפו תמונות מתפרשים על צגי מחשב ברזולוציה גבוהה. זה מאחסן את תמונות לשימוש עתידי ותומך בפרשנותו של המפעיל על ידי מתן נתונים עוצמת אור ניאון על התמונות. כמו כן מקדם מסווג תוצאות כחיוביות או שלילי, ומספק זיהוי תבניות עבור דגימות חיוביות. לסיכום, זה מבטל את הצורך בחדר חושך, ולאוטומטי ומייעל את readi IIFng / פרשנות זרימת עבודה. והכי חשוב, הוא מגביר את עקביות בין קוראים וקריאה. יתר על כן, עם השימוש בשקופיות המינימרקטים, שגיאות תעתיק בוטלו על ידי מתן עקיבות מדגם וזיהוי מטופל חיובי. התוצאה היא שלמות מוגברת מטופל נתונים ובטיחות.
המטרה הכללית של הסרטון הזה היא מדגים את הליך IIF, לרבות עיבוד שקופיות, זיהוי של דפוסי IIF משותפים, וכניסתה של התקדמות החדשה כדי לפשט ולהתאים את הטכניקה הזאת.
נוגדן antinuclear הטווח (ANA) מתאר מגוון רחב של נוגדנים עצמיים המגיבים עם מרכיבים של גרעין תא כולל DNA, חלבונים וribonucleoproteins 1, 2. תא הפ-2, מערך חלבוני יליד עם מאות אנטיגנים, מספק מצע אידיאלי לצורך זיהוי של 1 ANA. זיהוי של ANA בסרום אנושי הוא כלי חשוב להקרנת מחלות רקמת חיבור, וIIF הוא שיטת ההתייחסות לANA בדיקת 1. לאחרונה, IIF על הפ-2 תאים הוחלף בכמה מעבדות בimmunoassays אנטיגן ספציפי ושיטות זמנית. בשל חשש מתוצאות שליליות כוזבות וחוסר השקיפות לרופאים, הקולג' האמריקאי לראומטולוגיה הקים כוח המשימה שהגיע למסקנה כי IIF באמצעות הפ-2 תאים צריך להיות "תקן זהב" לANA הקרנת 1.
בשל האופי הסובייקטיבי של הקרנת ANA, איכות הפ-2 תאים היא בtegral לדיווח מדויק ובטוח בתוצאות. הנוכחות של מספר גבוה של תאי mitotic, מורפולוגיה אופטימלית תא, confluency מספיק, וביטוי של אנטיגנים רלוונטיים הם חשובים במיוחד. זיהוי תבניות IIF משמש ככלי חשוב כדי לסייע באבחון חולה. הבנת המשמעות של דפוסים שונים מאפשרת לרופאים ואנשי מעבדה לביצוע בדיקות המעקב המתאימות כדי לאשר את האבחנה. לדוגמא, דפוס ANA הומוגנית יכול להתרחש בנוכחות אנטי dsDNA או נוגדני הכרומטין, ועשוי להיות קשור עם זאבת אדמנתית מערכתית (לופוס) 3. מהצד השני, יש לו לאחרונה תואר כי הדפוס שנקרא צפוף הקנס המנומר (DFS), כי הוא נראה לרוב בעד 12% מהדגימות שגרתיות, יש בעיקר מזוהה עם נוגדנים נגד DFS70. נוגדנים עצמיים אלה, כאשר נמצאו בבידוד (ללא ANA ספציפי למחלה אחרת) אינם משויכים מחלות פרקים אוטואימוניות מערכתיות <sup> 4-9. בדיקות ובכך מאשרות לנוגדנים נגד DFS70 יכולות לעזור להפחית את בדיקות רפלקס מיותרות, מציעות חיסכון בעלויות ניכרות, ולהקל על חרדת מטופל.
בהתחשב בכך שIIF הוא המתודולוגיה הקרנת השורה הראשונה כדי לזהות נוגדנים עצמיים, זה הוא בעל חשיבות עליונה שהמשתמש מבין איך הבחירה של חומרים כימיים ומצעי רקמה יכולה להשפיע על תוצאות. מאז טכניקת IIF היא מטבעו סובייקטיבי, חשוב שהחומרים כימיים המשמשים לספק התוצאות באיכות הגבוהות ביותר.
מטרה זו של פרוטוקול וידאו זה היא קראתי למשתמש את הצעדים הנכונים הדרושים כדי לבצע את שיטת IIF, דפוסים הנפוצים הקשורות ANA, ולהציג את הפיתוחים חדשים אשר יכול לייעל את זרימת העבודה במעבדה ולתקנן תוצאות.
Screening by HEp-2 cells is a critical first step in the diagnosis of patients with SARD. However, IIF methods lack harmonization. Sources of variability include preparation of slides, conjugate specificity, and efficiency of the fluorescent microscope and experience of the reader. Despite these concerns, IIF remains the “gold standard” for ANA testing. HEp-2 cells contain a large variety of autoantigens, and provide the ideal substrate for the detection of these autoantibodies. In some laboratories, IIF has been replaced with solid phase screening methods such as multiplex assay or ELISA. The shortcoming of such tests is that they do not display the full range of antigens to be sufficiently sensitive. As a consequence, true positive patients may be missed which can have deleterious consequences In addition to the issues of treatment delay and wrong diagnosis, additional healthcare costs may occur due to the repetition of confirmatory tests or unnecessary diagnostic investigations. Given the inherent challenges to IIF, it is paramount to perform this technique properly to avoid subjectivity in results.
To ensure accurate interpretation and reporting of results for ANA screening, it is vital to use the highest quality substrate. When selecting a HEp-2 substrate, it is critical that the cells be optimized to express clinically relevant epitopes in their native protein state. Transfected or otherwise modified HEp-2 cell lines may not allow proper antibody-antigen binding. In addition, when several different autoantibodies are present simultaneously, recombinant cells may mask one or more patterns. High number of mitotic cells should also be present in the substrate. Adequate number of mitotic cells allows quick and accurate identification of patterns.
In addition to the attributes of the substrate, the objective of this video protocol is to describe the IIF technique by showing critical steps such as the addition of sample, slide washing, addition of conjugate, cover slipping, and determination of positive and negative results. Results can be compromised if proper technique is not used for each of these steps. Proper washing is important to remove all unbound antibody. Some patients display very high amounts of autoantibodies and in these cases it is important to wash the serum from the wells such that it does not contaminate other wells.
Although IIF has traditionally been a very labor intensive and subjective laboratory method, new technologies such as slide processors, barcoded slides and automated digital microscopy can greatly simplify the workflow, increase the consistency and reduce the sources of variability of interpretation.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לקסנדרה בראיינט לביצוע ניסוי IIF וקרול בוכנר לבדיקת המומחה הטכנית שלה.
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |