Utero-æggelederne Embryo Transfer og Sterilisation i musemodel

Summary

Utero-tubal ægoplægning bruger utero-tubal krydset som en barriere for at forhindre embryo udstrømning, der kan opstå, når du udfører uterin overførsel. Vasectomized mænd er forpligtet til at indhente pseudogravide modtagere til ægoplægning. Begge teknikker er diskuteret.

Abstract

Overførslen af ​​præimplantations embryoner til en surrogat kvinde er en nødvendig skridt til produktion af genetisk modificerede mus eller for at studere virkningerne af epigenetiske ændringer opstod under præimplantationsperioden udvikling på efterfølgende fosterudvikling og voksen sundhed. Brugen af ​​en effektiv og konsekvent ægoplægning teknik er afgørende for at forbedre den generation af genmodificerede dyr og til at bestemme effekten af ​​forskellige behandlinger på implantation satser og overlevelse til sigt. Embryoner på blastocyststadiet er normalt overføres af uterin overførsel, der udfører en punktering i livmodervæggen at indføre embryomanipulation pipette. Åbningen udføres i livmoderen ikke lukker efter pipetten er blevet trukket tilbage, og embryonerne kan udstrømningen bughulen på grund af det positive tryk i livmoderen. Punktering kan også producere en blødning, som forringer implantation, blokerer overførselspipetten og kan påvirke embryo ddvikling, især når embryoner uden zona overføres. Derfor denne teknik ofte resulterer i meget varierende og generelt lave embryo overlevelse. Undgå disse negative virkninger, utero-tubal ægoplægning drage fordel af den utero-tubal krydset som en naturlig barriere, der forhindrer embryo udstrømning og undgå punktur af livmodervæggen. Kræves vasectomized hanner for at opnå pseudogravide modtagere. En teknik til at udføre vasektomi er beskrevet som et supplement til den utero-tubal ægoplægning.

Introduction

Ægoplægning er formentlig den hyppigste kirurgiske indgreb udføres i musemodel. Denne teknik er afgørende for at opnå afkom fra fostre udsættes for in vitro-manipulation teknikker, og derfor er et nødvendigt skridt for udviklingen af genetisk modificerede modeller af pronuclear injektion, lentiviral transduktion eller kimære-dannelse. Udover, at teknikken tillader studiet af de udviklingsmæssige effekter af diverse fornærmelser opstår under præimplantationsperioden udvikling. Brugen af kunstige reproduktionsteknikker ¹ eller udsættelse for unormale koncentrationer af forskellige stoffer eller metabolitter ^{2 maj} påvirke embryo udvikling resulterer i implantation eller placentation fiaskoer og langtidsvirkninger i afkommet. En pålidelig og reproducerbar ægoplægning teknik er afgørende for at teste de mulige negative virkninger af den eksperimentelle behandling på implantation og fosterudvikling på en konsekvent mandner.

Murine præimplantations embryoner kan overføres til en recipient hun enten ind i æggelederen via ampuller på 0,5 dage efter coitum (dpc) pseudogravide modtagere (æggeleder overførsel) ^3,4 eller i uterus på 2,5 dpc pseudodrægtig modtager (uterin overførsel) ^5,6 afhængigt af deres udviklingsstadiet. Embryoner på blastocyststadiet, såsom dem der anvendes til at generere kimære mus ved injektion af embryonale eller inducerede pluripotente stamceller, der normalt overføres af uterin overførsel. Blastocyster kan også overføres til æggelederen af ​​en 0,5 DPC modtager, men den udgør en mindre fysiologisk test for udviklingsmæssige stoffer, fordi fosteret gennemgår diapause og har 2 dage til at komme sig fra den fornærmelse før implantation finder sted. Livmoder overførsel indebærer punktering af livmodervæggen med en smal kanyle for at generere en blænde, der giver mulighed for adgang af et foster manipulation pipette ind i livmoderen lumen. Aelv denne teknik kan give gode resultater, overlevelse til sigt (dvs. den procentdel af embryoner overføres der udvikle sig til en pup) ofte er lav og uforudsigelig ^7,8.

Punktur af livmodervæggen medfører nogle skadelige bivirkninger. Først myometrium er en yderst vaskulariseret væv og punktering resulterer ofte i en lille blødning. Blod kan blokere ægoplægningen pipette eller invadere livmoderens hulrum forårsager fosterdød og / eller implantation fiasko. Dette er især relevant, når embryoner uden zona overføres, da blodlegemer og snavs kan knytte til blastomererne. For det andet betyder det udførte åbning ikke forsegle efter embryonerne er blevet overført, så de kan flyde tilbage gennem åbningen og blive udvist til bughulen, da en for stor volumen er blevet introducere ind i livmoderen. Den utero-tubal ægoplægning beskrevet heri drage fordel af den utero-tubal krydset at levere embryos i livmoderen uden behov for punktering livmodervæggen og derved undgå dens negative konsekvenser ^9.

De pseudo modtagerlandene hunner anvendes til ægoplægning opnås ved naturlig parring med vasectomized hanner ^8. Der kræves skelsættende sekreter produceret af en steril mand for livmoderen til at blive modtagelige for de overførte embryoner. For at opnå en modtager, er et maksimum på 2 hunner på 8 uger til 6 måneder anbringes med en vasectomized mandlig i eftermiddag. Den følgende morgen, er hundyr kontrolleres for tilstedeværelsen af ​​en vaginal samleje stik, en klump af koaguleret proteiner fra den mandlige sædvæsken. Som parring sker normalt i løbet midnat, er den dag i vaginalprop opdagelse anses for at være 0,5 DPC. Selvom vasectomized hanner kan købes fra nogle leverandører, den kirurgiske procedure, der er beskrevet heri, er forholdsvis let og kræver ingen yderligere instrumenter, end der kræves til ægoplægning.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Beltsville Area Animal Care og brug komiteer (BAACUC 11-015) i overensstemmelse med USDA Animal Care og brug retningslinjerne. 1.. Anæstesi og Analgesi (Fælles for både kirurgiske procedurer) Musen vejes og indlæse følgende anæstesi og smertestillende i to 1 ml sprøjter med 27 g nåle: Ketamin (0,1 mg / g: 0,01 ml / g af en opløsning 10 mg / ml) og xylazin (0,01 mg / g: 0,005 ml / g af en 2 mg / m…

Representative Results

Utero-tubal ægoplægning giver et middel til at overføre embryoner til livmoderen undgå nogle af de komplikationer, der er forbundet til livmoderen ægoplægning 2,9,10. I tabel 1 viser vi nogle repræsentativt resultat, vi har opnået overføre CD1 blastocyster udsat for forskellige former for manipulationer CD1 modtagere efter protokollen beskrevet. Overlevelsen til termin (% af embryoner, i en pup) eller overlevelse til E15 (i tilfælde af lentivirus eksponerede) er ens mellem embryoner…

Discussion

Sterilisation er en forholdsvis ligetil kirurgisk teknik, der ikke indebærer store vanskeligheder. Ved desinfektion med povidon jod og ethanol sørge for, at den sidste vask (med ethanol) fjerner povidon jod, da det kan irritere bughinden. Adgangen til sædlederen kan også opnås ved pungen eller udfører en tværgående snit i maven ^8.. Scrotal indsnit er blevet anbefalet til tværgående abdominal incision på grund af den forholdsvis mindre indsnit nødvendigt og lidt bedre postoperativ adfærd …

Materials

Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Micro dissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8.
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used, they made narrower drops.