Маточно-трубное Эмбрион Трансфер и Вазектомия в мышиной модели
Summary
Маточно-трубное перенос эмбрионов использует маточно-трубное соединение в качестве барьера, чтобы предотвратить отток эмбриона, которые могут возникнуть при выполнении передачи матки. Вазэктомии мужчины обязаны получить псевдобеременных получателей переноса эмбрионов. Обсуждаются Оба метода.
Abstract
Перенос эмбрионов предимплантационной суррогатной женщина является необходимым шагом для производства генетически модифицированных мышей или изучать эффекты эпигенетических изменений возникла в процессе развития предимплантационной на последующее развитие плода и здоровье взрослых. Использование эффективной и последовательной методики переноса эмбриона имеет решающее значение для повышения поколение генетически модифицированных животных и определить влияние различных методов лечения на имплантации ставок и выживания к перспективе. Эмбрионы на стадии бластоцисты, как правило, передается переводом матки, выполняя прокол в стенке матки ввести манипуляции эмбрион пипетки. Отверстие выполняется в матке не закрывается после пипетка была снята, и эмбрионы могут отток в брюшную полость в связи с положительным давлением матки. Прокол может также произвести кровоизлияние, что ухудшает имплантацию, блокирует перенос пипетки и может повлиять эмбриона дАЗВИТИЕ, особенно когда эмбрионы без Zona передаются. Следовательно, этот метод часто приводит к очень переменными и общей выживаемости низким эмбриона. Как избежать этих негативных последствий, маточно-трубное перенос эмбрионов воспользоваться маточно-трубное стыке как естественный барьер, который препятствует оттоку эмбриона и избежать прокола стенки матки. Вазэктомии мужчин необходимы для получения псевдобеременных получателей. Техника для выполнения вазэктомии описывается как дополнение к маточно-трубное переноса эмбрионов.
Introduction
Перенос эмбрионов, вероятно, наиболее часто хирургическая процедура, проводимая в модели мыши. Эта техника имеет важное значение для получения потомства от эмбрионов, подвергнутых в пробирке методов манипуляции и, следовательно, является необходимым шагом для развития генетически модифицированных моделей по пронуклеусов инъекции, лентивирусным трансдукции, или образования химер. Кроме того, методика позволяет изучение развития последствий различных оскорблений, происходящих в процессе разработки предимплантационной. Использование искусственных репродуктивных технологий 1 или воздействия аномальных концентраций различных веществ или метаболитов 2 мая влияют на развитие эмбриона в результате имплантации или плаценты неудач и долгосрочных эффектов у потомства. Надежные и воспроизводимые техника перенос эмбрионов имеет решающее значение для проверки возможных негативных последствий экспериментального лечения по имплантации и развития плода в согласованном человеканер.
Мышиные эмбрионы предимплантационная могут быть переданы женщина получателя либо в яйцевод через ампул 0,5 дней после коитуса (ЦОД) псевдобеременных получателей (передача яйцевод) 3,4 или в матку 2,5 получателя псевдобеременных DPC (передача матки) 5,6 в зависимости от их стадии развития. Эмбрионов на стадии бластоцисты, такие как те, которые используются для генерирования химерных мышей путем инъекции эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, которые обычно передаются путем перевода матки. Бластоцисты также могут быть переданы в яйцевод реципиента 0,5 DPC, но она представляет собой менее физиологическое испытание для разрушителей развития, потому что эмбрион претерпевает диапаузы и имеет 2 дня, чтобы оправиться от инсульта до имплантации происходит. Передача матки включает в себя прокалывание стенки матки с узкой иглы, чтобы генерировать отверстие, что позволяет доступ эмбриона манипуляции пипетки в просвет матки.отя эта техника может дать хорошие результаты, выживание в перспективе (то есть процент эмбрионов, которые развиваются на щенка) часто низкая и непредсказуемым 7,8.
Прокол стенки матки влечет за собой некоторые негативные побочные эффекты. Во-первых, миометрий является высоко развитую сосудистую ткань, и его прокол часто приводит к небольшим кровотечением. Кровь может блокировать перенос эмбрионов пипетки или вторгаться матки просвет вызывая эмбриональную смерть и / или неудачи имплантации. Это особенно актуально, когда эмбрионы без Zona передаются, так как кровяные клетки и мусор можно прикрепить к бластомеров. Во-вторых, открытие выполнены не запечатывает после эмбрионы были переданы, так что они могут течь обратно через отверстие и быть исключен в брюшной полости при слишком большой объем был ввести в матку. Маточно-трубное перенос эмбрионов описано здесь воспользоваться маточно-трубное стыке доставить EMBRйо в матку без необходимости прокалывания стенки матки и таким образом избегая его негативных последствий 9.
Самки получателей псевдобеременных, используемые для переноса эмбрионов получены путем естественного спаривания с вазэктомии мужчин 8. В семенных выделений, полученные с помощью стерильных самцов необходимы для матки, чтобы стать восприимчивыми к переданных эмбрионов. Для получения адресата, максимум 2 самок 8 недель до 6-месячного возраста размещаются с вазэктомии мужчина днем. На следующее утро, женщины проверяются на наличие вагинального совокупления вилкой, скопления коагулированных белков из мужской семенной жидкости. Как спаривания обычно происходит во время полуночи, в день влагалища обнаружения плагина считается 0,5 сантиметр. Хотя вазэктомии самцы могут быть приобретены у некоторых производителей, хирургической процедуры описанные здесь относительно легко и не требует никаких дополнительных инструментов, чем требуется для переноса эмбриона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вазэктомия является относительно прямой хирургическая техника, которая не включает в себя основные трудности. При дезинфекции с повидон-йод и этанола убедитесь, что в прошлом для мытья (этанолом) удаляет повидон йод, так как это может вызвать раздражение брюшины. Доступ к семяпровод?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана за счет средств Департамента животных и птичьего наук к БТ.
Materials
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Micro dissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30G) can be also used. 25G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 um filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in ref. 8. |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used, they made narrower drops. |
Referências
- Fernandez-Gonzalez, R., et al. Long-term effect of in vitro culture of mouse embryos with serum on mRNA expression of imprinting genes, development, and behavior. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 101, 5880-5885 (2004).
- Bermejo-Alvarez, P., Roberts, R. M., Rosenfeld, C. S. Effect of glucose concentration during in vitro culture of mouse embryos on development to blastocyst, success of embryo transfer, and litter sex ratio. 79, 329-336 (2012).
- Tarkowski, A. K. Experiments on the development of isolated blastomers of mouse eggs. Nature. 184, 1286-1287 (1959).
- Whittingham, D. G. Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature. 220, 592-593 (1968).
- McLaren, A., Biggers, J. D. Successful development and birth of mice cultivated in vitro as early as early embryos. Nature. 182, 877-878 (1958).
- McLaren, A., Michie, D. Studies on the transfer of fertilized mouse eggs to uterine foster-mothers. I. Factors affecting the implantation and survival of native and transferred eggs. J. Exp. Biol. 33, 394-416 (1956).
- Goto, Y., et al. The fate of embryos transferred into the uterus. J. Assist. Reprod. Gen. 10, 197-201 (1993).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. . Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2003).
- Chin, H. J., Wang, C. K. Utero-tubal transfer of mouse embryos. Genesis. 30, 77-81 (2001).
- Ramirez, M. A., Fernandez-Gonzalez, R., Perez-Crespo, M., Pericuesta, E., Gutierrez-Adan, A. Effect of stem cell activation, culture media of manipulated embryos, and site of embryo transfer in the production of F0 embryonic stem cell mice. Biol. Reprod. 80, 1216-1222 (2009).
- Miller, A. M., Wright-Williams, S. L., Flecknell, P. A., Roughan, J. V. A comparison of abdominal and scrotal approach methods of vasectomy and the influence of analgesic treatment in laboratory mice. Lab. Anim. 46, 304-310 (2012).
- Flecknell, P. A. . Laboratory Animal Anaesthesia. , (2009).
- Erhardt, W., Hebestedt, A., Aschenbrenner, G., Pichotka, B., Blumel, G. A comparative study with various anesthetics in mice (pentobarbitone ketamine-xylazine,carfentanyl-etomidate). Res. Exp. Med. 184, 159-169 (1984).
- Tarin, D., Sturdee, A. Surgical anaesthesia of mice: evaluation of tribromo-ethanol, ether, halothane and methoxyflurane and development of a reliable technique. Lab. Anim. 6, 79-84 (1972).
- Zeller, W., Meier, G., Burki, K., Panoussis, B. Adverse effects of tribromoethanol as used in the production of transgenic mice. Lab. Anim. 32, 407-413 (1998).
- Lieggi, C. C., et al. Efficacy and safety of stored and newly prepared tribromoethanol in ICR mice. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 17-22 (2005).
- Lieggi, C. C., et al. An evaluation of preparation methods and storage conditions of tribromoethanol. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 44, 11-16 (2005).
- Meyer, R. E., Fish, R. E. A review of tribromoethanol anesthesia for production of genetically engineered mice and rats. Lab. Anim. 34, 47-52 (2005).
- Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol. Reprod. 42, 432-440 (1990).
- Quinn, P., Barros, C., Whittingham, D. G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilizing capacity of human spermatozoa. J. Reprod. Fertil. 66, 161-168 (1982).
- Dios Hourcade, d. e., Perez-Crespo, J., Serrano, M., Gutierrez-Adan, A., A, B., Pintado, In vitro and in vivo development of mice morulae after storage in non-frozen conditions. Reprod. Biol. Endocrinol. 10, 62 (2012).
