未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム
Summary
このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。
Abstract
好中球は、感染および血液中のそれらの数に対する保護において重要な役割を果たして頻繁に診療所で測定される。低好中球数は感染症の高いリスクについて警告サインであるが、血液中の高い好中球数は、通常、進行中の感染症の指標である。その機能を達成するために、好中球はまた、感染症が発生する組織内に、彼らの人生の大半を費やし、血液から効果的に移動できるようにする必要がある。その結果、移行する好中球の能力の欠陥は、好中球は、血液中の適切な数で存在する場合にも、感染症のリスクを高めることができます。しかし、診療所での好中球の遊走能を測定することは、時間がかかり、困難な作業であり、多量の血液、及び専門的な知識が必要になります。これらの制限に対処するために、我々はまわり、未処理の血液の一滴を必要とする好中球遊走のためのロバストなマイクロ流体アッセイを設計した好中球の分離の必要性を通気し、簡単な顕微鏡で定量化することは容易である。このアッセイでは、好中球は、化学誘引物質源に向かって、小さなチャネルを通して、血液の液滴から直接移行します。同じチャネルを介して赤血球の粒状流れを防止するために、我々は、選択的に赤血球の進行をブロックすることになり直角と機械的にフィルタを実装した。我々は、指穿刺および静脈血から採取された血液の液滴からの好中球遊走を比較することによりアッセイを検証した。我々はまた、精製された好中球のサンプルから好中球の遊走これらの全血（WB）のソースを比較し、3ソース間の一貫性の速度と方向性を見つけた。このマイクロ流体プラットフォームは、健康と病気における好中球機能の理解を進めるために役立つクリニックや研究環境で、人間の好中球遊走の研究が可能になります。
Introduction
好中球の人身売買は、アテローム性動脈硬化症1、細菌感染症や敗血症2を含む多くの炎症状態の進行と解像度を決定する上で重要な役割を果たしており、傷害3を焼く。健康と病気の状態への主要な貢献のために、好中球数は、多くの場合、臨床および研究実験室で検討標準的な血液分析の一部である。しかし、ほとんどのユビキタス試験の一つであるにも関わらず、感染症や敗血症の診断における好中球数の値が頻繁に4を疑問視されている。例えば、熱傷患者における好中球の1の研究では、好中球数及び好中球遊走機能は相関しないことを明らかにした。好中球が単独で数えることを意味して免疫状態3の正確な指標ではありません。測定することはより困難であるが、好中球の機能的能力は、広範囲の条件でより価値として提案されている。
tは ">重要なのは、好中球の欠陥の多くは一過性であり、恒久的な遺伝的欠陥によってトリガされず、大部分は最近まで、診療所で見過ごされてきた区別は。火傷の文脈では、好中球遊走はもちろん中に監視することができた炎症状態または感染3の指標として、患者の治療が、彼 らは大量の血液を必要とするため、現在の研究室（Boydenチャンバー、ダン室、マイクロピペットアッセイ）で使用される従来の移動アッセイは、臨床現場に翻訳することができず、面倒で時間のかかる好中球の単離技術（ 表1）。好中球の単離のために必要な血液の量は、一つのサンプルのみを可能にし、多くの場合、偶数のプーリングを必要とするため、これらのアッセイはまた、マウスなどの実験小動物における好中球走化性の過渡的変化を監視するために使用することができない単一のアッセイのための複数の動物から血液が、例えば、関係する研究では、M複数の時点にわたるultiple条件や治療は、潜在的に、現在の走化性アッセイを用いて、マウスの数千を必要とする可能性があります。これは、損傷、感染症との関連で、免疫機能の複雑な力学を理解したり、多くの場合、マウスモデル5で研究を燃やすために行うことができる基本的な生物学的研究を制限します。最小限の血液量を必要としながら、迅速なロバストである好中球機能アッセイの必要性に対処するために、我々は、全血の小滴から直接好中球走化性を測定するマイクロ流体デバイスを開発した。これは、血清6および7を含む血小板を全血には多くの要因が、好中球機能に影響を与えることが知られている。なお、全血のマイクロ流体アッセイはin vitroアッセイで8走化性における変化を測定するとき、好中球のインビボでの微小環境を維持するために、試料の処理を最小限に抑えることが有益である。このアプローチわずか数分（ 表1）に、従来の技術を用いて時間で好中球遊走アッセイに採血からの時間を低減する。全血のマイクロ流体プラットフォームは、実験期間のための安定した直線的誘引物質勾配を生成し、可動部品がなく、外部の圧力源（ すなわちシリンジポンプ）を必要としない。全血のマイクロ流体デバイスの設計における重要な特徴は、機械装置の移動路に入るのRBCをフィルタリングする赤血球（RBC）を濾過コムの組み込みである。このろ過櫛の右ターンはおそらく赤血球で詰まることになるサイズ排除濾過の必要性を防ぐため、WBに積極的に移行し、好中球に到達する化学誘引物質勾配を遮断する。 12または24ウェルプレート中の全血のマイクロ流体装置の組み込みは、ヒトまたはマウスの好中球走化性siを複数のメディエーターのスクリーニングを容易にする同時進行。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、血液の小滴（2μL）から好中球の走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォームを開発しました。積極的に好中球の移行からのRBCのオンチップ·機械的ろ過は、好中球を活性化することにより、成果物を導入する傾向があるような密度が10の勾配などの煩雑な細胞分離方法は、ポジティブ選択11、または負の選択12の必要性を回避する。 RBCの機械的…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国立衛生研究所からのサポートはしてシュライナーズホスピタル·バーンズ（GM092804、DE019938を付与）。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
Referências
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