Microfluidic Platform voor het meten neutrofielchemotaxis van onverwerkte volbloed
Summary
Dit protocol Gegevens een test ontwikkeld om menselijk neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed met robuuste reproduceerbaarheid. Deze benadering omzeilt de noodzaak van neutrofielen scheiding en vereist slechts een paar minuten assay voorbereidingstijd. De microfluïdische chip maakt het mogelijk de herhaalde meting van neutrofielchemotaxis loop van de tijd bij zuigelingen of kleine zoogdieren, waar monster volume beperkt is.
Abstract
Neutrofielen spelen een essentiële rol in de bescherming tegen infecties en hun aantallen in het bloed wordt vaak gemeten in de kliniek. Hoger aantal neutrofielen in het bloed zijn meestal een indicator van de lopende infecties, terwijl een lage neutrofielen zijn een waarschuwing voor hogere risico's op infecties. Om hun taken te volbrengen, neutrofielen moeten ook effectief te kunnen verplaatsen van het bloed, waar ze het grootste deel van hun leven door te brengen, in de weefsels, waar infecties optreden. Bijgevolg kunnen defecten in het vermogen van neutrofielen migreren risico verhogen op infecties, zelfs als neutrofielen aanwezig in geschikte aantallen in het bloed. Echter, het meten van de migratie van neutrofielen mogelijkheid in de kliniek is een uitdagende taak, die is tijdrovend, vereist een grote hoeveelheid bloed, en expertkennis. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een robuust microfluïdische assays voor de migratie van neutrofielen, die een enkele druppel bloed onverwerkte vereist, omstandigopeningen de noodzaak van neutrofielen scheiding en is gemakkelijk te kwantificeren op een eenvoudige microscoop. In deze assay, neutrofielen migreren direct uit het bloed druppeltje, door kleine kanalen, naar de bron van chemoattractant. Om de granulaire stromen van rode bloedcellen voorkomen dat via dezelfde kanalen, implementeerden we mechanische filters met rechte hoek blijkt dat het voorschot van rode bloedcellen selectief blokkeren. We gevalideerde de test door de migratie van neutrofielen vergelijken van bloed druppels verzameld uit vingerprik en veneuze bloed. We vergeleken ook deze volbloed (WB) bronnen met de migratie van neutrofielen uit monsters van gezuiverd neutrofielen en vonden constante snelheid en richting tussen de drie bronnen. Dit microfluïdische platform zal de studie van neutrofielen migratie menselijke staat in de kliniek en de instelling onderzoek helpen ons begrip van neutrofielen functies in gezondheid en ziekte.
Introduction
Neutrofielen handel speelt een cruciale rol bij het bepalen van de voortgang en oplossen van vele inflammatoire aandoeningen, zoals atherosclerose 1, bacteriële infectie of sepsis 2 en brandwonden 3. Voor hun belangrijke bijdrage aan de gezondheid en ziekte voorwaarden, aantal neutrofielen is onderdeel van de standaard bloedanalyse vaak beschouwd in klinische en onderzoekslaboratoria. Ondanks dat een van de meest alomtegenwoordige proeven en de waarde van neutrofielen in de diagnose van infectie en sepsis is herhaaldelijk ondervraagd 4. Bijvoorbeeld, een studie van neutrofielen bij patiënten met brandwonden is gebleken dat het aantal neutrofielen en de migratie van neutrofielen functie komen niet overeen; betekent dat neutrofielen alleen is niet een nauwkeurige indicator van immune status 3. Hoewel moeilijker te meten, heeft neutrofielen functionele bevoegdheid voorgesteld als meer waardevol in een breed scala van omstandigheden.
t "> Belangrijk veel neutrofielen gebreken voorbijgaande en worden niet veroorzaakt door permanente genetische defecten, een onderscheid dat grotendeels over het hoofd gezien in de kliniek tot voor kort. In het kader van brandwonden kunnen neutrofiel migratie tijdens gecontroleerd behandeling van een patiënt als een indicator van ontstekingsstatus of infectie 3. Traditionele migratie assays momenteel in het laboratorium (Boyden-kamer, Dunn kamer, micropipet assay) kan worden vertaald naar een klinische omgeving omdat ze grote hoeveelheden bloed nodig en omslachtig tijdrovend neutrofielen isolatietechnieken (tabel 1). Deze testen kunnen ook niet worden gebruikt om tijdelijke neutrofiel chemotaxis in kleine proefdieren, zoals muizen volgen, aangezien het volume van bloed nodig voor neutrofielen isolatie maakt slechts een monster en vereist vaak zelfs bundelen bloed van meerdere dieren een enkele assay. Bijvoorbeeld, een studie waarbij multiple voorwaarden en behandelingen over meerdere tijdstippen kan mogelijk duizenden muizen vereisen het gebruik van de huidige chemotaxis assays. Dit beperkt het fundamenteel biologisch onderzoek dat kan worden gedaan om de complexe dynamiek van de immuunfunctie te begrijpen in de context van verwonding, infectie of verbranden vaak bestudeerd in muizenmodellen 5.Om de noodzaak van een neutrofiel functionele test die is snel, robuust, terwijl die minimaal volume bloed pakken hebben we een microfluïdische apparaat dat neutrofielchemotaxis meet direct van een kleine druppel bloed ontwikkeld. Het is bekend dat veel factoren in volbloed, zoals serum 6 pt 7 bloedplaatjes invloed neutrofielfunctie. Het is derhalve gunstig dat het volbloed microfluïdische assay minimaliseert monster verwerking de in vivo micro-omgeving van de neutrofielen handhaven wanneer het meten van variaties in chemotaxis met een in vitro assay 8. Deze aanpakvermindert de tijd van bloedafname tot neutrofielen migratie assays van uren met behulp van traditionele technieken, om slechts enkele minuten (Tabel 1). De volbloed microfluïdische platform produceert een lineaire gradiënt chemoattractant voor de duur van het experiment, heeft geen bewegende delen en geen externe drukbron (dwz spuitpomp) vereisen. Het belangrijkste kenmerk van het ontwerp van het volbloed microfluïdische apparaat is de opname van een rode bloedcel (RBC) filtratie kam die mechanisch filtert RBC betreden de migratie kanaal van de inrichting. De rechter bochten van deze filtratie kam voorkomen dat de noodzaak voor de grootte uitsluiting filtratie, die waarschijnlijk zouden worden verstopt door rode bloedcellen en dus blokkeren de chemoattractant gradiënt van het bereiken van het actief migreren neutrofielen in de WB. De opname van het volbloed microfluïdische inrichting een 12 of 24-well plaat vergemakkelijkt het screenen van meerdere mediatoren van menselijke of murine neutrofielchemotaxis sigelijkertijd.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit werk hebben we een microfluïdische platform om neutrofielchemotaxis meet van een druppel bloed (2 pi). De on-chip mechanische filtratie van RBC van actief neutrofielen migreren omzeilt de noodzaak voor omslachtige cellen scheidingsmethoden zoals dichtheidsgradiënten 10, 11 positieve selectie, negatieve selectie of 12, die gevoelig zijn voor artefacten introduceren door het activeren neutrofielen. De mechanische filtratie van RBC onderscheidt onze technologie van andere microfluïdische chi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Steun van de National Institutes of Health (verleent GM092804, DE019938) en Shriners Burns Hospital.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Device Fabrication | |||
| SU8 | Microchem | Y131273 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 1.1 lb. Kit | |
| Standard glass slides | Fisher Scientific | 125495 | 1 X 3 inches |
| Glass-bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0mm | Ted Pella, Inc. | 15081 | |
| Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm | Ted Pella, Inc. | 15072 | |
| Microfluidic Assay Preparation and Analysis | |||
| Gel-loading pipet tip | Fisher Scientific | 02-707-139 | |
| Syringe | Fisher Scientfic | 309602 | |
| Blunt tip needle, 30g ½ in. | Brico Medical Supply | BN3005 | |
| Vacutainer, Heparin | Becton Dickinson | ||
| HBSS | Sigma-Aldrich | ||
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A5843-5G | 0.2% final concentration in HBSS |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895-1MG | |
| fMLP | Sigma-Aldrich | F3506-10MG | |
| SurgiLance safety lancet, 2.2mm depth, 22 gauge | SLN240 | ||
| Hoescht stain | Life Technologies | H3570 | |
| Positive Control | |||
| HetaSep | STEMCELL Technologies Inc. | 7906 | |
| EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit | STEMCELL Technologies Inc. | 19257 | |
| Equipment | |||
| Plasma Asher | March Instruments | P-250 | |
| Lindberg/Blue M Oven | Thermo Scientific | 13-258-30C | |
| Stainless Steel Precision Tweezers | Techni Tool | 758TW458 | |
| Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator | Fisher Scientific | 08-594-15A | |
| Dataplate Digital Hot Plate | Alpha Multiservices | PMC 720 | |
| Nikon TiE inverted microscope | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MEA53100 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x na 15.2wd Objective | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | MRH20101 | |
| Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon | Nikon – Micro Video Instruments Inc. | 500-L200NI2 | |
| DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32mm Exciters – 25mm Emitters | Chroma – Micro Video Instruments Inc. | 31013v2 | |
| Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1600×1200 pixels | Qimaging – Micro Video Instruments Inc. | RET-2000R-F-M-12-C |
Referências
- Hansson, G. K., Robertson, A. K., Soderberg-Naucler, C. Inflammation and atherosclerosis. Annual review of pathology. 1, 297-329 (2006).
- Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nature medicine. 17, 1381-1390 (2011).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS one. 5, (2010).
- Lavrentieva, A., et al. Inflammatory markers in patients with severe burn injury. What is the best indicator of sepsis. Burns : journal of the International Society for Burn Injuries. 33, 189-194 (2007).
- De Filippo, K., et al. Mast cell and macrophage chemokines CXCL1/CXCL2 control the early stage of neutrophil recruitment during tissue inflammation. Blood. 121, 4930-4937 (2013).
- Mankovich, A. R., Lee, C. Y., Heinrich, V. Differential effects of serum heat treatment on chemotaxis and phagocytosis by human neutrophils. PloS one. 8, (2013).
- Palabrica, T., et al. Leukocyte accumulation promoting fibrin deposition is mediated in vivo by P-selectin on adherent platelets. Nature. 359, 848-851 (1992).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (2012).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic chambers for monitoring leukocyte trafficking and humanized nano-proresolving medicines interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 20560-20565 (2012).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 412, 15-20 (2007).
- Lyons, P. A., et al. Microarray analysis of human leucocyte subsets: the advantages of positive selection and rapid purification. BMC genomics. 8, (2007).
- Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PloS one. 6, (2011).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab on a chip. 8, 2054-2061 (2008).
- Hoang, A. N., et al. Measuring neutrophil speed and directionality during chemotaxis, directly from a droplet of whole blood. Technology. , 1-9 (2013).
- Kurihara, T., et al. Resolvin D2 restores neutrophil directionality and improves survival after burns. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. , (2013).
- Buffone, V., Meakins, J. L., Christou, N. V. Neutrophil function in surgical patients. Relationship to adequate bacterial defenses. Arch Surg. 119, 39-43 (1984).
- Malawista, S. E., de Boisfleury Chevance, A., van Damme, J., Serhan, C. N. Tonic inhibition of chemotaxis in human plasma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 17949-17954 (2008).
