אפיון של מערכות מורכבות באמצעות העיצוב של גישת ניסויים: ביטוי חלבון חלוף בטבק כמקרה מבחן
Summary
אנו מתארים עיצוב של גישת ניסויים שיכולים לשמש כדי לקבוע ולעצב את ההשפעה של אלמנטי transgene רגולציה, פרמטרים גדילה והתפתחות צמח, ותנאי דגירה על הביטוי החולף של נוגדנים חד שבטיים וחלבונים כתב בצמחים.
Abstract
צמחים מספקים יתרונות רבים לייצור תרופות ביולוגיים כוללים עלויות נמוכות, יכולת הרחבה, ובטיחות. ביטוי חולף מציע יתרון נוסף של פיתוח קצר וזמני ייצור, אבל רמות הביטוי יכולות להשתנות באופן משמעותי בין קבוצות ובכך הולידו חששות רגולטורים בהקשר של ייצור נאות. אנחנו השתמשנו בעיצוב של גישת ניסויים (DOE), כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים מרכזיים כגון אלמנטים רגולטוריים במבנה הביטוי, גידול צמחים ופרמטרי פיתוח, ותנאי הדגירה בהבעה, בשונות של ביטוי בין קבוצות. בדקנו צמחים המבטאים נוגדן מודל אנטי HIV חד שבטי (2G12) וחלבון פלואורסצנטי סמן (DsRed). אנו דנים את הרציונל לבחירת מאפיינים מסוימים של המודל ולזהות מגבלות הפוטנציאל שלה. הגישה הכללית בקלות ניתן להעביר לבעיות אחרות, כי את עקרונות המודלמחדש החלים רחב: בחירת פרמטר המבוסס על ידע, הפחתת מורכבות על ידי פיצול הבעיה הראשונית לתוך מודולים קטנים יותר, מונחה תוכנת התקנה של שילובי ניסוי אופטימליים והגדלת עיצוב צעד חכמה. לכן, המתודולוגיה היא לא רק שימושית לאפיון ביטוי חלבון בצמחים, אלא גם לחקירה של מערכות מורכבות אחרות חסרות תיאור מכניסטי. משוואות החיזוי המתארות את הקישוריות בין פרמטרים ניתן להשתמש כדי להקים מודלים מכניסטית למערכות מורכבות אחרות.
Introduction
הייצור של חלבונים ביולוגיות בצמחים יש יתרון משום שצמחים הם זולים לגדול, הפלטפורמה וניתן לשנותם רק על ידי גידול צמחים יותר, ופתוגנים אנושיים אינם מסוגלים לשכפל 1,2. אסטרטגיות ביטוי חולפות מבוססות למשל על החדירה של עלים עם Agrobacterium tumefaciens מספקת יתרונות נוספים בגלל הזמן בין נקודת מסירת DNA והמשלוח של מוצר מטוהר מצטמצם משנה לפחות מ 2 חודשים 3. ביטוי חולף משמש גם לניתוח פונקציונלי, למשל כדי לבדוק גנים ביכולתם להשלים את מוטציות אובדן של פונקציה או לחקור אינטראקציות חלבון 4-6. עם זאת, רמות ביטוי חולפות נוטות להראות גדולה יותר וריאציה אצווה כדי אצווה מ רמות ביטוי בצמחים מהונדסים 7-9. הדבר זה מפחית את הסבירות לכך שתהליכי ייצור ביולוגיות המבוססים על wi ביטוי החולףתהיה מאושר בהקשר של תרגול טוב ייצור (GMP), כי שחזור הוא תכונת איכות קריטית והוא כפוף להערכת סיכונים 10. וריאציה כזו יכולה גם להסוות את כל אינטראקציות שחוקרים מתכוונים לחקור. לכן, יצאנו לזהות את הגורמים העיקריים המשפיעים על רמות ביטוי חולפות בצמחים ולבנות מודל חיזוי כמותית באיכות גבוהה.
הגישה אחת גורם ב-פעמי (OFAT) משמשת לעתים קרובות כדי לאפיין את ההשפעה (אפקט) של פרמטרים מסוימים (גורמים) על התוצאה (בתגובה) של ניסוי 11. אבל זה לא טובים, כי הבדיקות בודדות (פועל) במהלך חקירה (ניסוי) תהיה מיושרת כמו פנינים במחרוזת דרך אזור הפוטנציאל מורחב על ידי הגורמים שנבדקו (מרחב תכנון). הכיסוי של עיצוב החלל, ולכן המידה של מידע ההופק מהניסוי הואדל, כפי שמוצג באיור 1 א 12. יתר על כן, תלות הדדית בין גורמים שונים (אינטראקציות גורם) יכולה להישאר נסתרת וכתוצאה מכך מודלים עניים ו / או החיזוי של אופטימה הכוזבת, כפי שמוצג באיור 1 ב 13.
ניתן להימנע מהחסרונות שתוארו לעיל באמצעות עיצוב של ניסויי גישה (DOE), שבריצות של ניסוי מפוזרות בצורה שווה יותר לאורך כל מרחב תכנון, כלומר יותר מגורם אחד הוא נע בין שתי ריצות 14. ישנם עיצובים מיוחדים לתערובות, הקרנת גורמים (עיצובי עצרת) ולכמת את השפעות גורם בתגובות (שיטות משטח תגובה, RSM ים) 15. יתר על כן, יכול להתממש RSMs עיצובים מרכזיים-מרוכבים אבל גם יכול להיות מושגת בצורה יעילה על ידי שימוש בתוכנות מיוחדות שניתן להחיל קריטריונים שונים לבחירה של ריצות. לדוגמא, מה שנקרא D-optimalitקריטריון y יבחר ריצות כך כדי למזער את השגיאה במקדמים של המודל וכתוצאה מכך, בעוד שקריטריון IV-האופטימלי בוחר ריצות כי להשיג את שונות התחזית הנמוכה ביותר בחלל העיצוב 15,16. RSM אנו מתארים כאן מאפשר לכמת המדויקים של ביטוי חלבון החולף בצמחים, אבל זה יכול בקלות להיות מועבר לכל מערכת מעורבת מספר (~ 5-8) גורמים מספריים (למשל טמפרטורה, זמן, ריכוז) וכמה (~ 2 – 4) גורמים משמעיים (למשל אמרגן, צבע) שבו תיאור מכניסטית אינו זמין או מורכב מדי לדגמן.
גישת מחלקת האנרגיה שמקורה במדעי החקלאות, אך התפשטה לאזורים אחרים בגלל זה הוא להעברה לכל מצב שבו כדאי להקטין את מספר ריצות צורך לקבל נתונים אמינים וליצור מודלים תיאורים עבור תהליכים מורכבים. זה בתורו הוביל להכללתה של מחלקת אנרגיה ב" ההדרכה לתעשייה, Q8 (R2) תרופות פיתוח ", שפורסם על ידי הרמוני הבינלאומי של דרישות טכניות עבור רישום של תרופות לשימוש בבני אדם (ICH) 17. DOE הוא כיום בשימוש נרחב במחקר ותעשייה 18 מדעיים. עם זאת, יש להקפיד במהלך התכנון והביצוע של הניסוי, כי בחירת תואר פולינום לא תקין למודל מרובה ליניארי רגרסיה (דגם בסיס) יכולים להציג את צורך בריצות נוספות למודל את כל השפעות הגורם בצורה נכונה. יתר על כן, פגום או חסר נתונים ליצור מודלים ופגומים שגויים תחזיות, ואף עלול למנוע כל ניסיון בניית מודל כפי שמתואר בסעיפי הפרוטוקול ודיון 18. בקטע הפרוטוקול, יהיה להגדיר תחילה אנו את צעדי תכנון החשובים ביותר לניסוי מבוסס RSM ולאחר מכן להסביר את העיצוב מבוסס על האיילה v8.1 תוכנת DesignExpert. אבל עיצובים דומים יכול להיות בנוי עם includi תוכנה אחרng JMP, Modde, וSTATISTICA. הליכי הניסוי ואחריו הוראות לניתוח נתונים והערכה.
איור 1. השוואה של OFAT והאיילה.. וריאציה רציפה של גורם אחד בכל פעם (OFAT) בניסוי (עיגולים שחורים, אדום וכחול) משיגה כיסוי נמוך של מרחב תכנון (אזורים בקעו). לעומת זאת, הווריאציה של יותר מגורם אחד בכל פעם באמצעות העיצוב של ניסויי אסטרטגיה (DOE) (עיגולים ירוקים) משפרת את הכיסוי ובכך הדיוק של המודלים וכתוצאה מכך. ב '. כיסוי מרחב תכנון המוטה אומר שניסויי OFAT (עיגולים שחורים) גם יכולים שלא לזהות את האזורים אופטימליים הפעלה (אדום) ולחזות פתרונות לא אופטימליים (עיגול שחור גדול), ואילו strategi מחלקת האנרגיהes (כוכבים שחורים) יש סיכוי גבוה יותר לזהות תנאים עדיפים (כוכב שחור גדול).
Protocol
Representative Results
Discussion
כל ניסוי דורש תכנון זהיר, כי משאבים הם לרוב נדירים ויקרים. זה נכון במיוחד לאסטרטגיות מחלקת אנרגיה בגלל שגיאות במהלך שלב תכנון (לדוגמא: בחירת דגם בסיס שאינו מכסה את כל אינטראקציות הגורם משמעותיות) באופן משמעותי יכולות לצמצם את כוח הניבוי של מודלים וכתוצאה מכך ובכ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד"ר תומס Rademacher למתן וקטור ppam צמח הביטוי ואבראהים אל עמדי לטיפוח צמחי טבק המשמשים במחקר זה. ברצוננו להודות לד"ר ריצ'רד מ Twyman לסיועו בעריכת כתב היד. עבודה זו בחלקו מומנה על ידי המועצה האירופית למחקר מתקדם גרנט "העתיד-פארמה", מספר הצעת 269,110 וFraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer עתיד הקרן).
Materials
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Tryptone | Carl Roth GmbH | 8952.2 | Media component |
| Yeast extract | Carl Roth GmbH | 2363.2 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH | K029.2 | Antibiotic |
| Agar-Agar | Carl Roth GmbH | 5210.2 | Media component |
| Escherichia coli K12 DH5a | Life technologies | 18263-012 | Microorganism |
| pPAM | GenBank | AY027531 | Cloning/expression vector; |
| NucleoSpin Plasmid | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740588.250 | Plasmid DNA isolation kit |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740609.250 | Plasmid DNA purification kit |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | n.a. | Spectrophotometer |
| NcoI | New England Biolabs Inc. | R3193L | Restrictionendonuclease |
| EcoRI | New England Biolabs Inc. | R3101L | Restrictionendonuclease |
| AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | Restrictionendonuclease |
| NEB 4 | New England Biolabs Inc. | B7004S | Restrictionendonuclease buffer |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Disodium tetraborate | Carl Roth GmbH | 4403.3 | Media component |
| EDTA | Carl Roth GmbH | 8040.2 | Media component |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 6352.4 | Media component |
| Bromophenol blue | Carl Roth GmbH | A512.1 | Color indicator |
| Xylene cyanol | Carl Roth GmbH | A513.1 | Color indicator |
| Glycerol | Carl Roth GmbH | 7530.2 | Media component |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 170-4406 | Gel electrophoresis chamber |
| Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK | DSMZ | 12365 | Microorganism |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | 4307000.658 | Electroporator |
| Beef extract | Carl Roth GmbH | X975.2 | Media component |
| Peptone | Carl Roth GmbH | 2365.2 | Media component |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | Media component |
| Magnesium sulfate | Carl Roth GmbH | 0261.3 | Media component |
| Carbenicillin | Carl Roth GmbH | 6344.2 | Antibiotic |
| Kanamycin | Carl Roth GmbH | T832.3 | Antibiotic |
| Rifampicin | Carl Roth GmbH | 4163.2 | Antibiotic |
| FWD primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCT CAG GAA GAG CAA TAC |
| REV primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCA AAG CGA GTA CAC AAC |
| 2720 Thermal cycler | Applied Biosystems | 4359659 | Thermocycler |
| RNAfold webserver | University of Vienna | n.a. | Software |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | n.a. | Rockwool block |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Omnifix-F Solo | B. Braun | 6064204 | Syringe |
| Murashige and Skoog salts | Duchefa | M 0222.0010 | Media component |
| Glucose | Carl Roth GmbH | 6780.2 | Media component |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Phytohormon analogon |
| BioPhotometer plus | Eppendorf | 6132 000.008 | Photometer |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| Biacore T200 | GE Healthcare | n.a. | SPR device |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
Referências
- Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
- Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
- Shoji, Y., et al. A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens. Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).
- Berg, R. H., Beachy, R. N. Fluorescent protein applications in plants. Method Cell Biol. 85, 153 (2008).
- Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria. Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).
- Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
- Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building. Bioengineered. 4, (2013).
- Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins. Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).
- Daniel, C. One-at-a-time plans. Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).
- Czitrom, V. One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician. 53, 6 (1999).
- Anderson, M. J., Kraber, S. L. Keys to successful designed experiments. ASQ – The global voice of quality. 6, 6 (1999).
- Montgomery, D. C. . Design and Analysis of Experiments. , (2007).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. . Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , (2009).
- Piepel, G. F. Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions. J Qual Technol. 20, 15 (1988).
- . . FDA. , (2009).
- Shivhare, M., McCreath, G. Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design. BioProcess International. 8, 9 (2010).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5’UTR combination. Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. . DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. . Response Surface Methods Simplified. , (2005).
- De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression. Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).
- . . Plasmid DNA purification User manual. , (2012).
- . . PCR clean-up Gel extraction User manual. , (2012).
- . . Quick Ligation Protocol. 4, (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. Electroporation protocols for Agrobacterium. Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).
- Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).
- Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface. J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).
- Newcombe, A. R., et al. Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments. Process Biochem. 41, 842-847 (2006).
- Peixoto, J. L. Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models. Am Stat. 41, 311-313 (1987).
- Peixoto, J. L. A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models. Am Stat. 44, 26-30 (1990).
- Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).
- Ma, J. K. C., et al. Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants. Science. 268, 716-719 (1995).
- Wycoff, K. L. Secretory IgA antibodies from plants. Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).
- Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).
