Drug-induceret sensibilisering af adenylylcyclase: Assay Strømlining og Minituriasering for Small Molecule og siRNA Screening Applications
Summary
Vedvarende aktivering af hæmmende G-protein-koblede receptorer resulterer i sensibilisering af adenylylcyclase signalering. At identificere de væsentlige molekylære veje, er det nødvendigt nonbiased tilgange, men denne strategi kræver udvikling af en skalerbar celle-baserede cAMP sensibilisering assay. Heri beskriver vi en sensibilisering assay for lille molekyle og siRNA screening.
Abstract
Sensibilisering af adenylylcyclase (AC) signalering har været impliceret i en række neuropsykiatriske og neurologiske lidelser, herunder stofmisbrug og Parkinsons sygdom. Akut aktivering af Gαi / O-bundet receptorer hæmmer AC aktivitet, mens vedvarende aktivering af disse receptorer resulterer i heterolog sensibilisering af AC og øgede niveauer af intracellulær cAMP. Tidligere undersøgelser har vist, at denne forøgelse af AC modtagelighed observeres både in vitro og in vivo efter kronisk aktivering af flere typer Gαi / O-koblede receptorer, herunder D2 dopamin og μ opioidreceptorer. Selv heterolog sensibilisering af AC blev først rapporteret fire årtier siden, den mekanisme (r), der ligger til grund for dette fænomen fortsat er stort set ukendte. Manglen på mekanistiske data formentlig afspejler kompleksiteten forbundet med denne adaptive respons, hvilket tyder på, at nonbiased tilgange kan støtte i at identificerening af de molekylære veje involveret i heterolog sensibilisering af AC. Tidligere undersøgelser har impliceret kinase og Gbγ signalering som overlappende komponenter, der regulerer det heterologe sensibilisering af AC. At identificere unikke og yderligere overlappende mål, der er forbundet med sensibilisering af AC, der er nødvendigt for at øge gennemløb udvikling og validering af en skalerbar cAMP sensibilisering assay. Tidligere fremgangsmåder til at studere overfølsomhed er generelt besværlige involverer kontinuerlig cellekultur vedligeholdelse samt en kompleks metode til måling af cAMP-akkumulering, der involverer flere vasketrin. Således vil udviklingen af en robust cellebaseret assay, der kan anvendes til screening med højt gennemløb (HTS) i en 384-brønds format lette fremtidige studier. Ved hjælp af to D 2 dopamin receptor cellulære modeller (dvs.. CHO-D 2L og HEK-AC6 / D 2L), har vi konverteret vores 48-godt sensibilisering assay (> 20 trin 4-5 dage) til en fem-stoe, enkelt dag assay i 384-brønds format. Denne nye format er modtagelig for lille molekyle screening, og vi vise, at dette assay design kan også let anvendes til omvendt transfektion af siRNA i forventning om målrettet siRNA bibliotek screening.
Introduction
En adaptiv adenylylcyklase (AC) signalering respons kendt som heterolog-eller super-sensibilisering blev først opdaget i laboratoriet af nobelprisvinder Dr. Marshall Nirenberg. Dr. Nirenberg foreslog, at den observerede øgede AC lydhørhed efter kronisk δ opioid receptor-aktivering var en mekanisme, der er involveret i opiat tolerance og afhængighed 1. Ud over den kroniske δ opioid receptor aktivering, denne neuroadaptive reaktion AC signalering forekommer også efter vedvarende aktivering af flere andre Gαi / o-koblede receptorer 2. Især er mange af disse receptorer er forbundet med smerter, neuropsykiatriske og neurologiske sygdomme, og omfatter μ / κ opioid, D 2/4 dopamin, 5HT 1A, og M 2/4 muscarinreceptorer 2. Ud over Dr. Nirenberg resultater, eksisterer en stor mængde beviser, der forbinder sensibilisering af AC signalering til kronisk opioid receptor-aktivering både <em> in vitro og de vivo 3-7. Sensibilisering af AC har også været forbundet med en række sygdomme, der involverer D 2-lignende dopaminreceptorer herunder skizofreni og Parkinsons sygdom (for en gennemgang se reference 2). På trods af den potentielle betydning af overfølsomhed, den nøjagtige mekanisme (r) er forbundet med vedvarende Gαi / o-receptor-aktivering, som fører til øget AC reaktionsevne forbliver stort set ukendt.
Disse undersøgelser giver rationalet for behandlingen af mekanismerne for sensibilisering af adenylylcyclase som en vigtig neurobiologiske mål. Ligeledes bør den fysiologiske relevans af AC signalering 8 og den betydning, at de enkelte AC isoformer holder i denne adaptive respons også anerkendes 2,9,10. I forbindelse med vores forskning, de generelle træk forbundet med heterolog sensibilisering af de rekombinante isoformer af AC parallelt disse kendetegn destilskrevet for at studere de endogene isoformer af AC. Konkret har tidligere forskning fundet, at aktiveringen af Gαi / o proteiner og efterfølgende frigivelse / omlejring βγ subunits er vigtige krav for receptor-induceret sensibilisering af alle AC-isoformer. Derudover tyder flere undersøgelser, der signalering fra protein kinaser og Gβγ underenheder er involveret i sensibilisering 2,11-13. Individuelle ACs vise også unikke og distinkte overfølsomhedsreaktioner mønstre 12. For eksempel er vedholdende eksponering af D 2-receptorer til agonister associeret med sensibilisering af AC1 og AC8 til Ca 2 + / calmodulin stimulation 14,15, mens den nært beslægtede AC3 ikke er sensibiliseret 2. AC2, AC4 og AC7 er nært beslægtede, er imidlertid kun PKC-stimuleret AC2 aktivitet håndfast sensibiliseret efter længere tids eksponering af D 2-receptorer til agonister 7,14,16,17. Derudover AC5 og AC6 en markant grad af heterologous sensibilisering til Gas-og forskolinstimuleret cAMP akkumulering efter aktivering af D 2-receptorer 14,18-20, men ser ud til at variere i deres krav om Gβγ subunit-AC interaktioner 21. Selv om de fleste undersøgelser af AC sensibilisering har brugt model cellelinjer (f.eks HEK293 celler, der udtrykker de enkelte AC isoformer), fremgår det, at disse resultater oversætte til indfødte neuronale cellemodeller 4,22. Mere for nylig, kan virkningerne af AC isoform selektive inhibitorer med små molekyler identificeret i HEK293-celler, der udtrykker AC isoformer også oversat til in vivo adfærdsmæssige undersøgelser 23.
Manglen på en identificeret molekylære mekanisme for heterologe sensibilisering sandsynligvis afspejler kompleksiteten af det adaptive respons samt de unikke regulerende egenskaber af den enkelte AC isoformer 12. Optrevling sådan kompleksitet kompliceres yderligere ved brug af besværlige metode that har begrænset akademiske efterforskere fra at ansætte upartiske tilgange. For eksempel er involveret vores tidligere mekanistiske undersøgelser brugen af løbende dyrkede cellulære modeller ved hjælp af 24 – og 48-godt vævskultur format 15. Dyrkede celler blev typisk dyrket i 48 timer og derefter udsat for agonist lægemiddelbehandling (2-18 timer), efterfulgt af en række cellevaske og inkubationer (Figur 1). AC-isoform specifik cAMP-akkumulering protokoller blev derefter anvendt efterfulgt af måling af cAMP-akkumulering ved anvendelse af en omstændelig og tidskrævende [3H] cAMP bindende metode 15,24. Varigheden fra start til slut for hvert assay, generelt i alt fire til fem dage fra celleudpladning dataanalyse (figur 1). Anvendelsen af nye teknologier og automatisering har ført til markante forbedringer for overfølsomhedsreaktioner studier i industri-og HTS center indstilling. For eksempel er en gruppe, der arbejder med National Center for Chemical Genomics rapporteret et todages HTS assay procedure til at identificere småmolekyleinhibitorer af μ opioid receptor inducerede sensibilisering i 1.536-godt format 25.
Nærværende artikel beskriver vores bestræbelser på at udvikle et HTS assay for studier af heterolog overfølsomhed ved hjælp af teknologier, der er tilgængelige på de fleste akademiske forskningsinstitutioner. Denne strategi blev udført ved at inkorporere anvendelsen af kryopræserverede celler fra cellemodeller heterologt udtrykker D2 dopaminreceptor i kombination med endogene eller individuelle rekombinante adenylylcyclase isoformer (CHO-D 2L eller HEK AC6 / D 2 L). For at forbedre vores gennemløb, vi redesignet vores 48 godt sensibilisering assay (ca.> 20 trin over 4-5 dage) til en fem-trins, enkelt dag assay i 384-godt format, der i det væsentlige var "mix og læse." Det nye format bruger en kommercielt tilgængelig homogen tid løst fluorescens (HTRF) assay til måling af cAMP accumulation i intakte celler med en multi-mode pladelæser. Assayet er robust og modtagelig for lille molekyle screening, og effektivt kan anvendes til at screene for inhibitorer af heterologe sensibilisering. Derudover leverer vi data, der tillader brug af dette assay med omvendt transfektion af siRNA for målrettet eller genom bred siRNA bibliotek screening med kun en mindre ændring i den generelle indstilling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I et forsøg på at lette undersøgelser af heterolog sensibilisering, har vi væsentligt ændret vores tidligere metode at opnå en strømlinet "mix og læs" format, der er amendable til high-throughput screening og virkningsmekanisme undersøgelse. De store ændringer i vores protokol kan sammenfattes som følger: 1) brug af kryopræserverede celler som "assay-ready" reagenser, 2) miniaturisering af analysen i 384-brønds format og 3) udnyttelse af HTRF måling af cAMP.
…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Mr. Richard Zink og Todd Wiernicki for metodisk træning og assay vejledning. Vi takker også Johannes Paul Spence omhyggelig læsning og redaktionelle forslag. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, og Eli Lilly and Company gennem Lilly Research Award Program (LRAP).
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referências
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A “genome-to-lead” approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
