Sensibilisation à la drogue induit des adénylylcyclase: Rationalisation de dosage et la miniaturisation des petites molécules et siARN préalable Applications
Summary
Activation persistante des inhibiteurs G récepteurs couplés aux protéines résultats dans la sensibilisation de la signalisation de l'adénylcyclase. Pour identifier les voies moléculaires essentiels, les approches non biaisée sont nécessaires, mais, cette stratégie nécessite le développement d'un test AMPc de sensibilisation à base de cellules évolutive. Ici, nous décrivons un test de sensibilisation pour une petite molécule et le dépistage siRNA.
Abstract
Sensibilisation de l'adénylcyclase de signalisation (AC) a été impliqué dans une variété de troubles neuropsychiatriques et neurologiques y compris la toxicomanie et la maladie de Parkinson. Activation aiguë de Gai / o-récepteurs liés inhibe l'activité AC, alors que l'activation persistante de ces récepteurs résulte en une sensibilisation hétérologue de l'AC et l'augmentation des niveaux d'AMPc intracellulaire. Des études antérieures ont démontré que cette amélioration de la réactivité AC est observée à la fois in vitro et in vivo suite à l'activation chronique de plusieurs types de récepteurs Gai / o-lié, y compris la dopamine D 2 et les récepteurs opioïdes μ. Bien que la sensibilisation hétérologue de l'AC a été signalée il ya quatre décennies, le mécanisme (s) qui sous-tendent ce phénomène restent encore largement méconnus. Le manque de données mécanistiques reflète sans doute la complexité de cette réponse adaptative, ce qui suggère que les approches non biaisée pourraient aider à identifierment les voies moléculaires impliquées dans la sensibilisation de l'AC hétérologue. Des études antérieures ont mis en cause kinase et la signalisation Gbγ comme chevauchant composants qui régulent la sensibilisation hétérologue de l'AC. Pour identifier les cibles se chevauchent uniques et supplémentaires liées à la sensibilisation de l'AC, le développement et la validation d'un dosage de l'AMPc de sensibilisation évolutive est nécessaire pour augmenter le débit. Les approches précédentes pour étudier la sensibilisation sont généralement lourdes impliquant continu entretien de culture cellulaire ainsi que d'une méthodologie complexe pour mesurer l'accumulation d'AMPc qui implique plusieurs étapes de lavage. Ainsi, le développement d'un dosage à base de cellules robuste qui peut être utilisé pour le criblage à haut débit (HTS) dans un format de 384 puits facilitera les études futures. L'utilisation de deux modèles cellulaires D 2 de récepteurs de la dopamine (par exemple. CHO-D 2L et HEK-AC6 / D 2L) nous avons converti notre test de sensibilisation de 48 puits (> 20 étapes 4-5 jours) pour un cinq-step, dosage de jour en format de 384 puits. Ce nouveau format se prête à criblage de petites molécules, et nous démontrer que cette conception de l'essai peut également être facilement utilisé pour la transfection inverse de siRNA en prévision de criblage d'une banque de siRNA ciblés.
Introduction
Un adénylylcyclase adaptatif (AC) de signalisation de réponse connu comme hétérologue-ou super-sensibilisation a été découvert dans le laboratoire du Prix Nobel, le Dr Marshall Nirenberg. Dr Nirenberg a proposé que la réactivité accrue de CA observé suite à l'activation chronique des récepteurs opioïdes δ était un mécanisme impliqué dans la tolérance aux opiacés et la dépendance 1. En plus de l'activation chronique des récepteurs opioïdes δ, cette réponse neuroadaptatif de signalisation AC se produit également après l'activation persistante de plusieurs autres Gai / o-récepteurs couplés 2. Notamment, beaucoup de ces récepteurs sont associés à la douleur, les troubles neuropsychiatriques et neurologiques, et comprennent μ / κ des opioïdes, D 2/4 de la dopamine, 5HT 1A, et M 2/4 2 récepteurs muscariniques. En plus des découvertes du Dr Nirenberg, un grand nombre de preuves existe reliant sensibilisation de signalisation AC à l'activation du récepteur opioïde chronique à la fois <em> in vitro et de vivo 3-7. Sensibilisation des AC a également été associée à une variété de maladies impliquant les récepteurs dopaminergiques D 2 et telles que la schizophrénie y compris la maladie de Parkinson (pour une revue voir référence 2). Malgré l'importance potentielle de la sensibilisation, le mécanisme (s) précis associé avec / activation persistante Gai o-récepteur couplé qui conduit à une réactivité accrue AC reste en grande partie inconnue.
Ces études fournissent la justification de l'examen des mécanismes de sensibilisation de l'adénylyl cyclase comme une cible neurobiologique importante. De même, la pertinence physiologique de signalisation AC 8 et l'importance que les isoformes de CA individuels détiennent dans cette réponse adaptative devraient aussi être reconnus 2,9,10. Dans le cadre de notre recherche, les caractéristiques générales associées à la sensibilisation hétérologue des isoformes recombinantes de AC parallèle les caractéristiques described pour étudier les isoformes endogènes de l'AC. Plus précisément, des recherches antérieures ont montré que l'activation de Gai / o protéines et les sous-unités de la suite de presse / réarrangement sont des conditions importantes pour récepteur induite par la sensibilisation de toutes les isoformes AC. En outre, plusieurs études suggèrent que la signalisation de protéines kinases et des sous-unités Gßy sont impliqués dans la sensibilisation 2,11-13. CA individuels présentent également des motifs uniques et distincts de sensibilisation 12. Par exemple, l'exposition persistante des récepteurs D 2 agonistes est associée à une sensibilisation de AC1 et AC8 de Ca2 + stimulation / calmoduline 14,15, tandis que l'AC3 étroitement liée n'est pas sensibilisé 2. AC2, AC4, et AC7 sont étroitement liés, cependant, que l'activité de la PKC-AC2 stimulée est robuste sensibilisés après une exposition prolongée de D 2 récepteurs agonistes 7,14,16,17. En outre, AC5 et AC6 montrent un degré marqué de hetersensibilisation ologous à gaz et stimulée par la forskoline accumulation d'AMPc suite à l'activation de récepteurs D 2 14,18-20, mais semblent différer dans leur exigence de la sous-unité Gßy AC interactions 21. Bien que la plupart des études de sensibilisation AC ont utilisé des lignées de cellules modèles (par exemple des cellules HEK293 exprimant les isoformes individuelles AC), il apparaît que ces résultats traduisent par des modèles de cellules neuronales natives 4,22. Plus récemment, les effets des inhibiteurs sélectifs des isoformes de petites molécules identifiées AC dans les cellules HEK293 exprimant isoformes AC peuvent également être convertis en études comportementales in vivo 23.
L'absence d'un mécanisme moléculaire identifié pour la sensibilisation hétérologue reflète probablement la complexité de la réponse adaptative aussi bien que les propriétés uniques de la régulation individuelle des isoformes AC 12. Démêler une telle complexité est encore compliquée par l'utilisation de la méthodologie lourde tchapeau a limité chercheurs universitaires d'employer des approches impartiales. Par exemple, nos études mécanistiques précédentes impliquaient l'utilisation de modèles cellulaires cultivées en continu en utilisant 24 – et 48-bien le format de culture tissulaire 15. Les cellules cultivées ont été généralement cultivées pendant 48 h et ensuite soumis à un traitement médicamenteux agoniste (2-18 h), suivie par une série de lavages et d'incubations de cellules (figure 1). Protocoles d'accumulation d'AMPc spécifique AC-isoformes ont ensuite été utilisée suivie par la mesure de l'accumulation d'AMPc en utilisant une laborieuse et longue [3 H] AMPc méthodologie 15,24 liaison. La durée de bout en bout pour chaque dosage généralement nécessaire d'un total de quatre à cinq jours à partir de la cellule de placage à l'analyse de données (figure 1). L'application de nouvelles technologies et l'automatisation a conduit à des améliorations marquées pour les études de sensibilisation dans le milieu industriel et centre de HTS. Par exemple, un groupe de travail avec le Centre national pour Chemical génomique a rapporté deux jours une HTS procédure de dosage pour identifier des inhibiteurs de petites molécules de récepteur opioïde μ sensibilisation induite en format 1536 puits 25.
Le présent article décrit nos efforts pour développer un test HTS pour les études de sensibilisation hétérologue utilisant des technologies qui sont disponibles à la plupart des institutions de recherche universitaires. Cette stratégie a été accompli en incorporant l'utilisation de cellules congelées à partir des modèles de cellules exprimant de manière hétérologue au récepteur de la dopamine D 2, en combinaison avec les isoformes de l'adénylyl cyclase ou de recombinaison endogènes individuels (CHO-D 2L ou HEK-AC6 / D 2 L). Pour améliorer notre rendement, nous avons repensé notre test de sensibilisation de 48 puits (environ> 20 étapes sur 4-5 jours) pour un cinq-étape, le dosage de jour en format 384 puits qui était essentiellement "mélanger et lire". Le nouveau format utilise un temps homogène fluorescence disponible dans le commerce résolu (HTRF) d'essai pour mesurer l'AMPc accumulation dans des cellules intactes avec un lecteur multi-plaque de mode. Le dosage est robuste et se prêtent à criblage de petites molécules, et peut être efficacement appliqué pour cribler des inhibiteurs de la sensibilisation hétérologue. En outre, nous fournissons des données qui permet l'utilisation de ce test avec la transfection inverse de siRNA pour une large criblage d'une banque de siRNA ciblés ou de génomes avec seulement une modification mineure à l'approche générale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans un effort pour faciliter les études de sensibilisation hétérologue, nous avons largement modifié notre méthode précédente réalisation d'un rationalisé "mélange et de lire" format qui est modifiable à criblage à haut débit et le mécanisme de l'examen de l'action. Les principales modifications apportées à notre protocole peuvent être résumées comme suit: 1) l'utilisation de cellules congelées comme réactifs "de dosage prêt"; 2) la miniaturisation de l'anal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier M. Richard Zink et Todd Wiernicki pour la formation méthodologique et des conseils de dosage. Nous remercions également Jean-Paul Spence pour lecture attentive et suggestions d'ordre rédactionnel. Ce travail a été soutenu par l'Institut national de la santé 060 397 MH, Fondation Brain and Behavior Research, et Eli Lilly and Company à travers le Programme de bourses de recherche Lilly (LRAP).
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referências
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