Farmaco-indotta Sensibilizzazione della ciclasi: L'ottimizzazione del dosaggio e miniaturizzazione per piccole molecole di siRNA e applicazioni di screening
Summary
L'attivazione persistente del inibitori G recettori accoppiati alla proteina provoca sensibilizzazione della segnalazione ciclasi ciclasi. Per identificare le vie molecolari essenziali, sono necessari approcci nonbiased, tuttavia, questa strategia richiede lo sviluppo di una base cellulare scalabile saggio cAMP sensibilizzazione. Qui, descriviamo un test di sensibilizzazione per la piccola molecola e lo screening siRNA.
Abstract
Sensibilizzazione di adenilato ciclasi (AC) segnalazione è stata implicata in una varietà di disturbi neuropsichiatrici e neurologici compreso abuso di sostanze e il morbo di Parkinson. L'attivazione acuta di Gαi / recettori o-linked inibisce l'attività AC, mentre l'attivazione persistente di questi recettori provoca sensibilizzazione eterologa di AC e aumento dei livelli di cAMP intracellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che questo miglioramento di reattività AC è osservato sia in vitro che in vivo in seguito all'attivazione cronica di diversi tipi di recettori / O-linked Gαi compresi D 2 della dopamina e recettori oppioidi μ. Sebbene sensibilizzazione eterologa di AC è stata segnalata per la prima di quattro decenni fa, il meccanismo (s) che sono alla base di questo fenomeno restano in gran parte sconosciute. La mancanza di dati meccanicistici presumibilmente riflette la complessità di questa risposta adattativa, suggerendo che gli approcci nonbiased potrebbero aiutare a identificarezione delle vie molecolari coinvolti nella sensibilizzazione eterologa di AC. Studi precedenti hanno implicato chinasi e segnalazione Gbγ come componenti che regolano la sensibilizzazione eterologa di AC sovrapposizione. Per identificare gli obiettivi sovrapposti unico e aggiuntivi connessi con la sensibilizzazione di AC, lo sviluppo e la validazione di una soluzione scalabile test cAMP sensibilizzazione è necessaria per una maggiore produttività. Approcci precedenti per studiare sensibilizzazione sono generalmente ingombranti coinvolge cellulare continua cultura manutenzione nonché una complessa metodologia per misurare l'accumulo di cAMP che coinvolge più fasi di lavaggio. Pertanto, lo sviluppo di un saggio basato su cellule robusto che può essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento (HTS) in un formato ben 384 facilitare studi futuri. Utilizzando due modelli cellulari D 2 del recettore della dopamina (ad esempio. CHO-D 2L e HEK-AC6 / D 2L), abbiamo trasformato il nostro saggio di sensibilizzazione a 48 pozzetti (> 20 gradini 4-5 giorni) per un periodo di cinque-step, unico dosaggio giorno in formato 384-bene. Questo nuovo formato è suscettibile di proiezione piccola molecola, e ci dimostrano che questo motivo test può anche essere facilmente utilizzato per la trasfezione inversione di siRNA in previsione di uno screening della libreria siRNA mirati.
Introduction
Un ciclasi adattativo (AC) di segnalazione di risposta noto come-eterologo o super-sensibilizzazione è stato scoperto nel laboratorio del premio Nobel, il dottor Marshall Nirenberg. Il Dott. Nirenberg proposto che l'aumento della reattività AC osservata dopo l'attivazione dei recettori oppioidi δ cronica era un meccanismo coinvolto nella tolleranza e dipendenza da oppiacei 1. Oltre ai recettori oppioidi δ cronica, questa risposta neuroadaptive di segnalazione AC si verifica anche dopo l'attivazione persistente di diversi altri Gαi / o recettori accoppiati a 2. In particolare, molti di questi recettori sono associati con dolore, disturbi neuropsichiatrici e neurologici, e comprendono μ / κ oppioidi, D 2/4 dopamina, 5HT 1A, e M 2/4 recettori muscarinici 2. Oltre ai risultati del Dott. Nirenberg, un grande corpo di evidenze esiste collega sensibilizzazione della segnalazione AC all'attivazione cronica dei recettori oppioidi sia <em> in vitro e in vivo 3-7. Sensibilizzazione di AC è stata anche associata con una varietà di malattie che coinvolgono i recettori dopaminergici D 2-come compreso la schizofrenia e il morbo di Parkinson (per una rassegna vedi riferimento 2). Nonostante l'importanza potenziale di sensibilizzazione, il meccanismo preciso (s) associata a persistente / attivazione del recettore Gαi o accoppiato, che porta ad una maggiore reattività AC rimane in gran parte sconosciuta.
Questi studi forniscono il razionale per l'esame dei meccanismi di sensibilizzazione della ciclasi come un importante obiettivo neurobiologica. Analogamente, la rilevanza fisiologica di AC segnalazione 8 e l'importanza che le singole isoforme AC tengono in questa risposta adattativa dovrebbero essere riconosciuti 2,9,10. Nel contesto della nostra ricerca, le caratteristiche generali associati sensibilizzazione eterologa delle isoforme ricombinanti di AC paralleli tali caratteristiche described per studiare le isoforme endogeni di AC. In particolare, la ricerca precedente ha scoperto che l'attivazione di Gαi / o proteine e subunità successivo rilascio / riassestamento βγ sono requisiti importanti per il recettore indotta sensibilizzazione di tutte le isoforme AC. Inoltre, diversi studi suggeriscono che la segnalazione di proteine chinasi e subunità Gβγ sono coinvolti nella sensibilizzazione 2,11-13. AC individuali mostrano anche i modelli di sensibilizzazione uniche e distinte 12. Per esempio, l'esposizione persistente di D 2 recettori agonisti è associata con sensibilizzazione di AC1 e AC8 di Ca 2 + / calmodulina stimolazione 14,15, mentre la strettamente correlata AC3 non è sensibilizzata 2. AC2, AC4 e AC7 sono strettamente correlati, però, solo l'attività AC2 PKC-stimolata è robusto sensibilizzato dopo una prolungata esposizione di D 2 recettori agli agonisti 7,14,16,17. Inoltre, AC5 e AC6 mostrano una marcata grado di hetersensibilizzazione ologous a gas e forskolina stimolata cAMP accumulo a seguito di attivazione dei recettori D2 14,18-20, ma sembrano differire nella loro esigenza di Gβγ subunità-AC INTERAZIONI 21. Sebbene la maggior parte degli studi di sensibilizzazione AC hanno utilizzato linee cellulari modello (ad esempio cellule HEK293 che esprimono le singole isoforme di AC), sembra che questi risultati si traducono in modelli cellulari neuronali nativi 4,22. Più recentemente, gli effetti della isoforma AC selettivi piccole molecole inibitrici identificati in cellule HEK293 esprimenti isoforme CA possono anche essere tradotti in studi comportamentali in vivo 23.
La mancanza di un meccanismo molecolare identificato per la sensibilizzazione eterologa probabilmente riflette la complessità della risposta adattativa nonché le uniche proprietà regolazione individuale isoforme AC 12. Dipanare tale complessità è ulteriormente complicata dall'utilizzo di ingombrante metodologia tCappello ha limitato ricercatori accademici da impiegare approcci imparziali. Ad esempio, i nostri precedenti studi meccanicistici comportato l'utilizzo di modelli cellulari continuamente coltivate con 24 – e 48-ben formato coltura di tessuti 15. Cellule in coltura erano tipicamente coltivate per 48 ore e quindi sottoposti a trattamento farmacologico con agonisti (2-18 ore) seguito da una serie di lavaggi cellulari e incubazione (Figura 1). Protocolli accumulo di cAMP specifico AC-isoforma erano poi impiegato seguita dalla misurazione di accumulo di cAMP utilizzando un laborioso e richiede tempo [3 H] cAMP metodologia 15,24 vincolante. La durata dall'inizio alla fine di ciascun saggio generalmente richiesto un totale di quattro o cinque giorni da placcatura cella per l'analisi dei dati (Figura 1). L'applicazione di nuove tecnologie e l'automazione ha portato a miglioramenti marcati per gli studi di sensibilizzazione in ambiente industriale e HTS centro. Ad esempio, un gruppo di lavoro con il Centro Nazionale per Chemical Genomics ha riportato una due giorni HTS procedura di analisi per l'identificazione di piccole molecole inibitrici di μ recettori oppioidi sensibilizzazione indotta in formato 1.536-ben 25.
Il presente articolo descrive i nostri sforzi per sviluppare un test HTS per studi di sensibilizzazione eterologa utilizzando tecnologie che sono disponibili presso la maggior parte degli istituti di ricerca universitari. Questa strategia è stata realizzata incorporando l'uso di cellule crioconservati da modelli cellulari eterologhi che esprime il recettore dopaminergico D 2 in combinazione con endogeni o singoli ricombinanti isoforme ciclasi (CHO-D 2L o HEK-AC6 / D 2 L). Per migliorare il nostro rendimento, abbiamo ridisegnato la nostra sensibilizzazione test ben 48 (ca.> 20 passi oltre 4-5 giorni) per un periodo di cinque step, test solo giorno in formato 384-bene che era essenzialmente "mix e leggere". Il nuovo formato utilizza un tempo omogeneo disponibile in commercio fluorescenza risolta (HTRF) test per misurare cAMP accumulation in cellule intatte con un lettore di piastra a più modalità. Il test è robusto e suscettibili di proiezione piccola molecola, e può essere efficacemente applicata a screening per inibitori di sensibilizzazione eterologa. Inoltre, forniamo i dati che permettono l'uso di questo test con trasfezione inversione di siRNA a una vasta libreria di siRNA lo screening mirati o del genoma con solo una piccola modifica per l'impostazione generale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel tentativo di facilitare gli studi di sensibilizzazione eterologa, abbiamo ampiamente modificato il nostro metodo precedente realizzare una struttura snella "mix e leggere" formato che è modificabile a high-throughput screening e il meccanismo di esame azione. Le principali modifiche al nostro protocollo possono essere riassunti come segue: 1) l'uso di cellule crioconservate come reagenti di saggio "pronto", 2) la miniaturizzazione del dosaggio in 384 pozzetti, e 3) l'utilizzazione della …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il signor Richard Zink e Todd Wiernicki per la formazione metodologica e di orientamento dosaggio. Ringraziamo anche Giovanni Paolo Spence un'attenta lettura e proposte editoriali. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health MH 060.397, Brain and Behavior Research Foundation, e Eli Lilly and Company attraverso il Research Award Program Lilly (LRAP).
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referências
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