아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화
Summary
아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.
Abstract
아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC) 신호의 과민 반응은 약물 남용 및 파킨슨 병 등의 신경 정신 및 신경 질환의 종류에 연루되어있다. Gαi / O를 결합 수용체의 급성 활성화는 AC의 활성을 억제, AC의 이종 감작에있는이 수용체 결과의 지속적인 활성화 및 세포 내 cAMP의 수준 증가하는 반면. 이전 연구는 AC의 응답 성이 향상이 D 2 도파민을 포함하고 오피오이드 수용체를 μ Gαi / O를 결합 수용체의 여러 종류의 만성 활성화 다음 시험 관내 및 생체 내에서 모두 관찰되는 것을 증명하고있다. AC의 이종 감작이 처음 사십 년 전에보고했지만,이 현상을 기초 메커니즘 (들)은 크게 알려지지 않은 남아있다. 기계적인 데이터의 부족은 아마도 nonbiased 방법 식별에 도움을 수 있다고 제안,이 적응 응답과 관련된 복잡성을 반영AC의 이종 과민 반응에 관여하는 분자 경로를 보내고. 이전 연구는 AC의 이종 과민 반응을 조절하는 구성 요소를 중복으로 키나제 및 Gbγ 신호를 내포하고 있습니다. AC의 과민 반응과 관련된 독특하고 추가 중복 표적을 확인하기 위해, 확장 성 캠프 민감성 분석의 개발 및 검증은 처리량이 필요합니다. 과민 반응을 연구하는 이전 방식은 연속적인 세포 배양 유지 보수뿐만 아니라 다수의 세척 단계를 포함 cAMP의 축적을 측정하는 복잡한 방법을 포함 일반적으로 복잡하다. 따라서, 384 웰 포맷에서 높은 처리량 스크리닝 (HTS)에 사용할 수있는 강력한 세포 기반 분석의 발전은 미래 연구를 용이하게한다. 두 개의 D 2 도파민 수용체 세포 모델 (예. CHO-D 2L와 HEK-AC6 / D 2L)를 사용하여, 우리는 다섯의 우리의 48 잘 증감 분석 (> 20 단계 4 ~ 5 일) 변환 한TEP, 384 – 웰 형식으로 하루의 분석. 이 새로운 형식은 작은 분자 검사 의무이며, 우리는이 분석의 디자인도 쉽게 대상의 siRNA 라이브러리 심사의 기대에 siRNA를 역 형질 전환을 위해 사용될 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
이종 또는 초 과민성으로 알려진 응답 신호 적응 아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC)를 첫 번째 노벨상 수상자, 마샬 박사 Nirenberg의 연구실에서 발견되었다. 박사 Nirenberg 만성 δ 아편 수용체 활성화 다음 관찰 증가 AC 응답이 아편 내성과 의존성 1에 관여하는 메커니즘이라고 제안했다. 만성 δ 아편 수용체 활성화뿐만 아니라, AC 신호의이 neuroadaptive 응답은 또한 여러 가지 다른 Gαi / O를 결합 수용체 2의 지속적인 활성화 다음 발생합니다. 특히,이 수용체의 대부분은 통증, 신경 정신 및 신경 장애와 연관 μ / κ 아편, D 2 / 4 도파민, 5HT 1A 및 M 2 / 4 무스 카린 수용체 2를 포함한다. 박사 Nirenberg의 발견에 더하여, 기록하는 큰 몸체의 양쪽 만성 오피오이드 수용체 활성화에 AC 신호의 감작을 연결 존재 <e생체 외 및 생체 내 3-7 미터>. AC의 감작도 (검토를 위해 참고 2 참조) 정신 분열증과 파킨슨 병 등의 D 2와 같은 도파민 수용체를 포함하는 다양한 질병과 관련이있다. 과민 반응의 잠재적 인 중요성에도 불구하고, 정확한 메커니즘 (들)은 AC 응답이 크게 알려지지 않은 남아 증가로 연결 지속 Gαi / O를 결합 수용체의 활성화와 관련.
이러한 연구는 중요한 신경 생물학적 대상으로 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 민감성에 대한 메커니즘을 조사하기위한 이론적 근거를 제공한다. 마찬가지로, 개별 AC 아형이 적응 응답하여 홀드 8 시그널링 AC의 생리 학적 관련성 및 중요성도 2,9,10을 인식해야한다. 우리의 연구의 맥락에서, AC의 재조합 이소 형의 이종 감작과 관련된 일반적인 특징은 그 특성을 평행 데AC의 내생 이소을 공부 cribed. 특히, 이전의 연구는 Gαi / O 단백질 및 후속 릴리스 / 재 배열 βγ 서브 유닛의 활성화는 모든 AC 이소 형의 수용체에 의한 감작을위한 중요한 요구 사항입니다 것을 발견했습니다. 또한, 여러 연구는 단백질 키나아제 및 Gβγ 서브 유닛에서 신호가 과민성 2,11-13에 참여하는 것이 좋습니다. 개별 ACS는 또한 독특하고 뚜렷한 증감 패턴 (12)을 표시합니다. 밀접한 관련이 AC3는 2 민감하지 반면 예를 들어, 효능에 D 2 수용체의 지속적인 노출은, 칼슘 2 + / 칼 모듈 린의 자극 (14, 15)에 AC1 및 AC8의 과민 반응과 연관되어 있습니다. AC2, AC4, 및 AC7 밀접 단, PKC 자극 AC2 활동이 견고 7,14,16,17을 주작 동근하는 D 2 수용체의 장기간 노출 후 민감하고, 관련이 있습니다. 또한, AC5 및 AC6은 heter의 현저한 정도를 나타냅니다ologous D 2 수용체 14,18-20의 활성화에 다음과 같은 가스와 포스 콜린 자극 캠프 축적에 과민 반응하지만, Gβγ 서브 유닛 – AC에 대한 자신의 요구 사항에 차이가 나타납니다 (21)를 상호 작용. AC 감작의 대부분의 연구 모델 세포주 (예를 들어 HEK293 세포는 각각의 AC 이소 형을 표현하는)를 사용하고 있지만, 이러한 연구 결과는 원시 신경 세포 모델 4,22로 번역 것으로 보인다. 더 최근에, AC 아형을 발현하는 HEK293 세포에서 식별 AC 이소 선택적 소분자 억제제의 효과는 또한 생체 행동 연구 (23)로 변환 할 수있다.
이종 감작위한 식별 분자 메커니즘의 부족 가능성 적응 반응의 복잡성뿐만 아니라 AC가 12 이소 폼의 개별 고유 규제 특성을 반영한다. 그러한 복잡성을 이루는 것이 더욱 성가신 방법론 t의 사용에 의해 복잡모자 공정한 방법을 사용에서 학술 조사를 제한하고있다. 48 잘 조직 문화 형식 (15) – 예를 들어, 우리의 이전의 기계 론적 연구 (24)를 사용하여 지속적으로 배양 세포 모델을 사용하고있었습니다. 배양 된 세포는 일반적으로 48 시간 동안 성장하고 세포 세척 및 배양 일련의 (그림 1) 다음에 효능 약물 치료 (2-18 시간)을 실시 하였다. AC-이소 특정 캠프 축적 프로토콜 캠프 방법론 15,24 바인딩 노동력과 시간이 소요 [3 H]를 사용하여 캠프 축적 측정한다 사용 후했다. 각각의 분석을 위해 처음부터 끝까지 지속 기간은 일반적으로 세포 도금의 데이터 분석 (그림 1)에 4-5일 총이 필요합니다. 새로운 기술과 자동화의 응용 프로그램은 산업 및 HTS 센터 설정에 감작 연구에 표시된 향상되었다. 예를 들어, 케미을위한 국립 센터와 협력 그룹칼 유전체학은 2 하루 1,536 잘 형식 25 μ 오피오이드 수용체에 의한 감작의 작은 분자 억제제를 식별하기위한 분석 절차를 HTS 보도했다.
본 기사는 대부분의 학술 연구 기관에서 사용할 수있는 기술을 사용하여 이종 과민 반응의 연구를위한 HTS 분석을 개발하는 우리의 노력을 설명합니다. 이 전략은 heterologously 내인성 또는 개별 재조합 아데 닐릴 시클 라제 이소 폼 (CHO-D 2L 또는 HEK-AC6 / D 2 L)와 조합 D 2 도파민 수용체를 발현하는 세포 모델에서 냉동 보관 세포의 사용을 통합함으로써 달성되었다. 우리의 처리량을 개선하기 위해, 우리는 기본적으로 "혼합 읽기"이었다 384 – 웰 형식의 5 단계, 하루의 분석에 우리의 48 개 감작 분석 (4-5 일 동안 ca.> 20 단계)를 재 설계. 새로운 형식은 캠프 ACC를 측정하기 위해 시중에서 균일 한 시간 해결 형광 (HTRF) 분석을 사용하여멀티 모드 플레이트 리더와 손상 세포 umulation. 분석은 강력하고 작은 분자 검사 의무, 그리고 효과적으로 이종 과민 반응의 억제에 대한 화면으로 적용 할 수 있습니다. 또, 일반적인 방법으로 오직 사소한 수정을 가진 대상 또는 게놈 와이드 siRNA의 라이브러리 스크리닝 된 siRNA의 형질 감염과 역방향이 분석의 사용을 허용 데이터를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이종 과민 반응의 연구를 촉진하기위한 노력의 일환으로, 우리는 광범위하게 우리의 이전 방법 효율적인 달성을 수정했습니다 "혼합 및 읽기"높은 처리량 검사 및 행동 검사의 메커니즘을 수정할 수있는입니다 형식. 다음과 같이 우리의 프로토콜에 큰 변형이 요약 될 수있다 : 1) "분석 준비"시약 등의 동결 보존 세포의 사용, 384 – 웰 포맷으로 분석의 2)의 소형화와, HTRF 둘레 3) 사용?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 방법론 교육 및 분석 지침 씨 리처드 아연 토드 Wiernicki을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한주의 읽기 및 편집 제안 요한 바오로 스펜스 감사합니다. 이 작품은 국민 건강 MH 060397, 두뇌와 행동 연구 재단과 일라이 릴리의 연구소와 릴리 연구 상 프로그램 (LRAP)를 통해 회사에 의해 지원되었다.
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
Referências
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